核酸的熒光探針

1、核酸的熒光探針吳思輝吳思輝 03081020基本原理 核酸本身在室溫下有較弱的內源熒光，但熒光量子產率低，不能直接測量，可用一些熒光小分子物質作為生物探針，與核酸作用后導致熒光強度的增強或減弱來進行測定。常用的探針物質 有機熒光染料 金屬配合物 金屬離子 納米粒子有機熒光染料 主要是基于嵌入核酸堿基對中，發(fā)生共振能量轉移而導致熒光強度的增強或減弱來進行測定。 能量轉移的形式是單重態(tài)單重態(tài)轉移，由一個發(fā)熒光的給體將能量傳給一受體，這個受體可發(fā)射自己的特征熒光（熒光增強），也可不發(fā)熒光（熒光猝滅）。金屬配合物 主要是基于配合物立體結構的發(fā)光性質，多是過渡金屬元素配合物。 測定中離子強度過高會影響D

2、NA的構象，使DNA表面的陰離子被屏蔽，降低核酸分子競爭陽離子的能力。酸度過低會使核酸中磷酸根質子化，而過高則會出現(xiàn)金屬的難溶物。另外有時蛋白質的存在會嚴重干擾測量，須預先去除再進行測定。納米粒子 某些納米粒子也可做為核酸檢測的熒光探針 與傳統(tǒng)的有機染料熒光探針相比，半導體納米晶體探針的光強度高20倍，熒光壽命長，光穩(wěn)定性高100倍，譜線寬度只是有機染料譜線寬度的1/3，因此大大提高了分析的靈敏度和選擇性。金屬離子 主要是基于某些稀土離子本身的發(fā)光特性 稀土離子的共振帶正好與核酸受紫外光激發(fā)時的三線態(tài)相重疊，能有效地發(fā)生從有機配體到中心離子之間的能量轉移。 該法具有光譜線寬窄、發(fā)光壽命長和能發(fā)

3、射特征熒光且與生物分子有很大親和力等特點。FOR EXAMPLE GMP在生物體內具有重要的生理功能。 研究表明，致癌物優(yōu)先結合到核酸中鳥嘌呤形成加合物。因而測定GMP具有重要的意義。 常用的熒光方法是基于GMP和苯甲基乙二醛在一定條件下反應進行測定。這種方法的選擇性較高，但必須在60下反應30分鐘，在如此高的溫度下會影響生物樣品的活性及熒光強度的穩(wěn)定性。 另外，有人將堿基衍生化，應用薄層色譜進行分離。應用色譜法分辨率較高，但所需時間長，一般需數小時，而且需制備特殊的柱子。 近年來發(fā)現(xiàn)稀土離子Tb3+與核酸結合后，其熒光強度可以增加數千倍以上，并且這種作用是專一的，核酸中僅GMP可以明顯地增強熒光，但此法若僅用Tb3+靈敏度又不太高。 后來發(fā)現(xiàn)的稀土共發(fā)光效應就很好地解決了這個問題。例如Gd3+加入Tb-GMP體系明顯地增強了該體系的熒光強度。 實驗表明，GMP的測量線性范圍達到3x10-8 -3x10-5mol/L，比Tb-GMP體系寬一個數量級 此外，它的檢測限達到3.9x I0-9 mol/l ，比后者低一個數量級。 ?機理呢? Gd3+對Tb3+的熒光