核酸的熒光探針

1、核酸的熒光探針吳思輝吳思輝 03081020基本原理 核酸本身在室溫下有較弱的內(nèi)源熒光，但熒光量子產(chǎn)率低，不能直接測(cè)量，可用一些熒光小分子物質(zhì)作為生物探針，與核酸作用后導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)或減弱來(lái)進(jìn)行測(cè)定。常用的探針物質(zhì) 有機(jī)熒光染料 金屬配合物 金屬離子 納米粒子有機(jī)熒光染料 主要是基于嵌入核酸堿基對(duì)中，發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)或減弱來(lái)進(jìn)行測(cè)定。 能量轉(zhuǎn)移的形式是單重態(tài)單重態(tài)轉(zhuǎn)移，由一個(gè)發(fā)熒光的給體將能量傳給一受體，這個(gè)受體可發(fā)射自己的特征熒光（熒光增強(qiáng)），也可不發(fā)熒光（熒光猝滅）。金屬配合物 主要是基于配合物立體結(jié)構(gòu)的發(fā)光性質(zhì)，多是過(guò)渡金屬元素配合物。 測(cè)定中離子強(qiáng)度過(guò)高會(huì)影響D

2、NA的構(gòu)象，使DNA表面的陰離子被屏蔽，降低核酸分子競(jìng)爭(zhēng)陽(yáng)離子的能力。酸度過(guò)低會(huì)使核酸中磷酸根質(zhì)子化，而過(guò)高則會(huì)出現(xiàn)金屬的難溶物。另外有時(shí)蛋白質(zhì)的存在會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)量，須預(yù)先去除再進(jìn)行測(cè)定。納米粒子 某些納米粒子也可做為核酸檢測(cè)的熒光探針 與傳統(tǒng)的有機(jī)染料熒光探針相比，半導(dǎo)體納米晶體探針的光強(qiáng)度高20倍，熒光壽命長(zhǎng)，光穩(wěn)定性高100倍，譜線寬度只是有機(jī)染料譜線寬度的1/3，因此大大提高了分析的靈敏度和選擇性。金屬離子 主要是基于某些稀土離子本身的發(fā)光特性 稀土離子的共振帶正好與核酸受紫外光激發(fā)時(shí)的三線態(tài)相重疊，能有效地發(fā)生從有機(jī)配體到中心離子之間的能量轉(zhuǎn)移。 該法具有光譜線寬窄、發(fā)光壽命長(zhǎng)和能發(fā)

3、射特征熒光且與生物分子有很大親和力等特點(diǎn)。FOR EXAMPLE GMP在生物體內(nèi)具有重要的生理功能。 研究表明，致癌物優(yōu)先結(jié)合到核酸中鳥(niǎo)嘌呤形成加合物。因而測(cè)定GMP具有重要的意義。 常用的熒光方法是基于GMP和苯甲基乙二醛在一定條件下反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。這種方法的選擇性較高，但必須在60下反應(yīng)30分鐘，在如此高的溫度下會(huì)影響生物樣品的活性及熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性。 另外，有人將堿基衍生化，應(yīng)用薄層色譜進(jìn)行分離。應(yīng)用色譜法分辨率較高，但所需時(shí)間長(zhǎng)，一般需數(shù)小時(shí)，而且需制備特殊的柱子。 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)稀土離子Tb3+與核酸結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度可以增加數(shù)千倍以上，并且這種作用是專一的，核酸中僅GMP可以明顯地增強(qiáng)熒光，但此法若僅用Tb3+靈敏度又不太高。 后來(lái)發(fā)現(xiàn)的稀土共發(fā)光效應(yīng)就很好地解決了這個(gè)問(wèn)題。例如Gd3+加入Tb-GMP體系明顯地增強(qiáng)了該體系的熒光強(qiáng)度。 實(shí)驗(yàn)表明，GMP的測(cè)量線性范圍達(dá)到3x10-8 -3x10-5mol/L，比Tb-GMP體系寬一個(gè)數(shù)量級(jí) 此外，它的檢測(cè)限達(dá)到3.9x I0-9 mol/l ，比后者低一個(gè)數(shù)量級(jí)。 ?機(jī)理呢? Gd3+對(duì)Tb3+的熒光