農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的咼效水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究A Highly Efficie ntAgrobacterium - mediated Rice Tran sformatio n Method水稻是基因組研究的模式植物，近年來(lái)水稻基因組研究取得了很大進(jìn)展，構(gòu)建了遺傳圖譜和物理圖譜，完成了秈稻和粳稻的全基因組草圖測(cè)2 - 3序，以及第1號(hào)和第4號(hào)染色體的精細(xì)測(cè)4 - 5序，并對(duì)第10號(hào)染色體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)分析。在此基礎(chǔ)上，各實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模地，系統(tǒng)地進(jìn)行水稻功能基因研究，普遍采用的研究手段是基因標(biāo)簽技術(shù)。基因標(biāo)簽技術(shù)包括T - DNA和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，創(chuàng)建大量的基因標(biāo)簽體是功能基因研究的材料平臺(tái)。而根癌農(nóng)桿菌介

2、導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化是水稻基因標(biāo)簽技術(shù)中的重要步驟之一。本研究完善了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化方法，以期為水稻功能基因研究提供豐富材料，為水稻重要農(nóng)藝性狀的改良開(kāi)辟途徑。1材料以水稻品種日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)為試驗(yàn)材料。菌株類型為 EHA105超毒力菌株，載體為增強(qiáng)子捕獲載體 pFX- E24. 2 - 15R( 見(jiàn)圖1),載體上帶有GUS報(bào)告基因、35 S的CaMV啟動(dòng)子序 列和潮霉素選擇標(biāo)記基因(HYG)。農(nóng)桿菌菌株為EHA105GAL4/罔1祓用pFXr E24.2- 15R上的T- DM%片設(shè)闿注：RB為T I)辭后邊界一 GM.4/VP16為酵M

3、桂錄激活了 GAL1DN.X粘合區(qū)弓單抱病癬VP陌激厝區(qū)站融合基囲伍心£為6 個(gè)璽復(fù)的上游激活序列”BoBS為SI菌垃餉(尊)朗秤酸覘娥I乩 CuMVSSS是花椰軻毒啟胡.IIYG址選擇林記華帙建T- DNA 帀邊界*2方法2.1水稻愈傷組織的誘導(dǎo) 誘導(dǎo)方法參照HIEI7等。將日本晴水稻種子去殼，用75 %乙醇滅菌5min， 再用2. 5 %的次氯酸鈉滅菌處理不同時(shí)間(40min，37 min ,30 min 和25 min)， 以確定最佳滅菌時(shí)間，滅菌后用無(wú)菌水沖洗 68次，于MS固體培養(yǎng)基上28 'C避光培養(yǎng)，30 d 后，將愈傷組織進(jìn)行繼代培 養(yǎng)，得到胚性愈傷組織。2.

4、2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織 用AB固體培養(yǎng)基+氯霉素25 mg/L + 利福平20 mg/L + AS 20 mg/L培養(yǎng)農(nóng)桿菌，在20 C下培養(yǎng)56 d。用無(wú)菌勺子輕輕刮下培養(yǎng)的農(nóng)桿菌，放入AAM液體培養(yǎng)基中(加有2 mg/L 2，4-D ,0.7 g/L 脯氨酸，20 mg/L AS）, 在80 rpm/min ,27'C下，搖蕩培養(yǎng)4 h。將挑好的胚性愈傷組織放入錐形瓶，菌液倒入另一錐形瓶中，并加入AAM培養(yǎng)基（+AS50mg/L）,分別調(diào)節(jié)OD600值至不同數(shù)值（0. 120、0. 145 、0. 158 、0. 190 、0. 195） , 以確定最佳的發(fā)桿菌濃度。然后將菌液倒入愈

5、傷組織中 , 用手 輕搖，感染15 min。再吸干菌液，將愈傷組織放入裝有濾紙的培養(yǎng)皿中干燥，移至共培養(yǎng)基上27 C下共培養(yǎng)34 d。2.3轉(zhuǎn)化體的獲得將共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)出，無(wú)菌水漂洗34次，再用NB培養(yǎng)基+ 50 mg/L 頭抱霉素在室溫下100 rpm搖洗12 h，洗2遍后吸干放在濾紙上。將吸干的愈傷組織轉(zhuǎn)入N6選擇培養(yǎng)基上（+ 50 mg/L 潮霉素+ 500 mg/L 頭抱霉素），27 C下暗培養(yǎng)20 d后，繼代一次。將新長(zhǎng)出的抗性愈傷組 織轉(zhuǎn)移到N6預(yù)分化培養(yǎng)基上，28 C下，暗培養(yǎng)7 d。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到N6分化培養(yǎng)基上，28下，光照12 h/ d，培養(yǎng)23周后，新鮮愈傷組織

6、將有綠點(diǎn)出現(xiàn)，每2周繼代一次，待分化出完整小苗后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基MS中。煉苗并移栽。2.4 GUS染色分析參照J(rèn)efferson 的方法，切取T0代轉(zhuǎn)化體的葉片、種子等器官進(jìn)行染色，在37 C下反應(yīng)1216 h，棄去染色液，用95 %的酒精脫色，在解剖顯微鏡下觀察拍照。染色液組成為50mM的磷酸鈉鹽緩沖液，pH7.0，10 mMEDTAD. 1 %TritonX- 100，1 mg/ml 的 X - Glue，0. 1 mM鐵氰化鉀，0.1mM亞鐵氰化鉀，20 %甲醇。3 結(jié)果與分析3.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響 滅菌是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵技術(shù)之一 ， 既要保證滅菌徹底 ， 又不能影 響種子萌

7、發(fā)和產(chǎn)生愈傷。用 2.5 % 次氯酸鈉對(duì) 200 粒種子分別處理 40 min 、 37 min 、 30min 和 25 min ， 結(jié)果表明 ， 隨著滅菌時(shí)間的增加 ， 愈傷誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)。滅菌 40 min 時(shí) ， 愈傷誘導(dǎo)率僅為 77 %，大部 分種子不能萌發(fā) ， 推測(cè)可能是胚已被到滅菌效果 ， 次氯酸鈉對(duì)種子萌發(fā)無(wú)影響 ， 種子萌發(fā)力強(qiáng) ， 但是由于 萌發(fā)消耗了很多養(yǎng)分 ， 反而部分抑制了愈傷組織的生長(zhǎng) ， 故其愈傷誘導(dǎo)率為 96.3 %， 反而低于滅菌 30 min 時(shí)的愈傷誘導(dǎo)率 97.3 % 。而且 ， 滅菌 40 min 和 37 min 時(shí) ， 形成的愈傷顆粒比較小 ，

8、侵染時(shí)易于褐死 ， 不利于轉(zhuǎn)化，而滅菌30 min時(shí)的愈傷顆粒大小在 3 mm左右，適合于轉(zhuǎn)化，且誘導(dǎo)率最高。因此，2. 5 % 次氯酸鈉的最適滅菌時(shí)間為 30min 。3.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 愈傷組織經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)后 ， 會(huì)產(chǎn)生體細(xì)胞突變 ， 不利于轉(zhuǎn)化體的篩選。同時(shí) ， 多代培養(yǎng)后 ， 愈傷組織逐漸衰老死亡 ， 將大大降低轉(zhuǎn)化效率。但是傳統(tǒng)的方法直接用 誘導(dǎo)的愈傷來(lái)轉(zhuǎn)化 ， 也會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率 ， 這可能是細(xì)胞的周期狀態(tài)影響了轉(zhuǎn)化效率 ， 有報(bào)道認(rèn)為當(dāng)愈傷組 織細(xì)胞處于細(xì)胞周期 S時(shí)期和G2周9期的比例高時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，而且S期是細(xì)胞DNA復(fù)制期，此時(shí)轉(zhuǎn)化有利于 T- 鏈

9、轉(zhuǎn)變成雙鏈 ， 增加穩(wěn)定整合和遺傳。所以經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)睦^代培養(yǎng) ， 可以使細(xì)胞處于轉(zhuǎn)化最 佳狀態(tài)而提高轉(zhuǎn)化效率。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察 ， 經(jīng)繼代培養(yǎng)后的愈傷組織表面光滑 ， 質(zhì)地致密 ， 粒形好 ， 繼代培養(yǎng)67d時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。培養(yǎng)時(shí)間太短，愈傷組織表面粗糙，粒小，不利于轉(zhuǎn)化；培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則愈傷組織變軟 , 發(fā)粘 , 轉(zhuǎn)化后易褐化死亡。3.3 農(nóng)桿菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響 農(nóng)桿菌濃度直接影響到轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌濃度太低時(shí) ， 每個(gè)愈傷組織 塊產(chǎn)生的抗性愈傷數(shù)極少 ， 大部分不產(chǎn)生抗性愈傷 ； 濃度太高 ， 則愈傷組織很容易被過(guò)度侵染 ， 共培養(yǎng)后 無(wú)法恢復(fù)活力 ， 在進(jìn)行選擇培養(yǎng)時(shí) ， 大多數(shù)會(huì)褐化死亡。本

10、研究用不同 OD 值的農(nóng)桿菌菌液分別處理生長(zhǎng) 狀況良好一致的300個(gè)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)當(dāng)OD6O0直為0.1450.190時(shí)，轉(zhuǎn)化效率基本保持在 79 %左右, 當(dāng)0D600值低于0. 145 時(shí)，轉(zhuǎn)化率較低，超過(guò)0. 190 時(shí)，愈傷死亡數(shù)量增多，并且選擇培養(yǎng)時(shí)，因過(guò) 多的農(nóng)桿菌覆蓋在抗性愈傷組織上 ， 抑制了其生長(zhǎng)。4 結(jié)論與討論農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響因子包括菌株類型、水稻基因類型、培養(yǎng)基成分組成、組織培養(yǎng)條件等。筆者 通過(guò)對(duì)日本晴水稻轉(zhuǎn)化條件的研究，發(fā)現(xiàn)在日本晴的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，當(dāng)種子滅菌30 min時(shí)，愈傷的誘導(dǎo)率最高，繼代培養(yǎng)67 d后的轉(zhuǎn)化率最高，菌濃度0D600值為0. 1450. 190

11、時(shí)，轉(zhuǎn)化效率高。另外，試 驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在分化培養(yǎng)時(shí) ， 黑暗條件下預(yù)培養(yǎng) 7 d 的可以大大減少愈傷組織的褐化程度 ， 分化效率達(dá)到 85 %。優(yōu)化后轉(zhuǎn)化體系大大減少了組織培養(yǎng)時(shí)間 ，3 個(gè)月即可獲得轉(zhuǎn)化植株 ， 不但節(jié)省成本 ， 而且減少由 于組培而激活 Tos17 等水稻內(nèi)源轉(zhuǎn)座子從而造成體細(xì)胞突變的頻率 。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)很成熟 ， 但是要適應(yīng)高通量的水稻基因組研究 ， 快速完成 T -DNA 插 入飽和突變體的創(chuàng)制 ， 需要大大提高抗性愈傷組織的分化效率。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織直接放 在同一培養(yǎng)基上進(jìn)行分化與選擇培養(yǎng) ， 容易造成愈傷組織因褐化而抑制分化。因?yàn)檫x擇培養(yǎng)基中含有的高 濃度抗生素使未轉(zhuǎn)化的愈傷組織褐化而產(chǎn)生酚類等有毒物質(zhì) ， 抑制了抗性愈傷組織的生長(zhǎng)和分化。有人對(duì) 傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行初步改進(jìn) ， 把抗性愈傷組織單獨(dú)放在含有抗生素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng) ， 但是由于抗生素 的影響以及分化培養(yǎng)基中的ABA等見(jiàn)光分解，結(jié)果直接影響了分化效果。筆者在此基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步的改進(jìn) ， 將選擇培養(yǎng)基上的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上 ， 然后放置在黑暗下培養(yǎng) 7 d ， 再轉(zhuǎn)到新的分化培 養(yǎng)基上光照下培養(yǎng) ， 只需 10 d 左右就能分化成苗 ， 分化效率可達(dá) 85 %。該方法的優(yōu)