農桿菌介導法

1、農桿菌介導的咼效水稻遺傳轉化體系的研究A Highly Efficie ntAgrobacterium - mediated Rice Tran sformatio n Method水稻是基因組研究的模式植物，近年來水稻基因組研究取得了很大進展，構建了遺傳圖譜和物理圖譜，完成了秈稻和粳稻的全基因組草圖測2 - 3序，以及第1號和第4號染色體的精細測4 - 5序，并對第10號染色體的結構進行了詳細分析。在此基礎上，各實驗室大規(guī)模地，系統(tǒng)地進行水稻功能基因研究，普遍采用的研究手段是基因標簽技術?；驑撕灱夹g包括T - DNA和轉座子標簽，創(chuàng)建大量的基因標簽體是功能基因研究的材料平臺。而根癌農桿菌介

2、導的水稻遺傳轉化是水稻基因標簽技術中的重要步驟之一。本研究完善了根癌農桿菌介導的水稻轉化方法，以期為水稻功能基因研究提供豐富材料，為水稻重要農藝性狀的改良開辟途徑。1材料以水稻品種日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)為試驗材料。菌株類型為 EHA105超毒力菌株，載體為增強子捕獲載體 pFX- E24. 2 - 15R( 見圖1),載體上帶有GUS報告基因、35 S的CaMV啟動子序 列和潮霉素選擇標記基因(HYG)。農桿菌菌株為EHA105GAL4/罔1祓用pFXr E24.2- 15R上的T- DM%片設闿注：RB為T I)辭后邊界一 GM.4/VP16為酵M

3、桂錄激活了 GAL1DN.X粘合區(qū)弓單抱病癬VP陌激厝區(qū)站融合基囲伍心£為6 個璽復的上游激活序列”BoBS為SI菌垃餉(尊)朗秤酸覘娥I乩 CuMVSSS是花椰軻毒啟胡.IIYG址選擇林記華帙建T- DNA 帀邊界*2方法2.1水稻愈傷組織的誘導 誘導方法參照HIEI7等。將日本晴水稻種子去殼，用75 %乙醇滅菌5min， 再用2. 5 %的次氯酸鈉滅菌處理不同時間(40min，37 min ,30 min 和25 min)， 以確定最佳滅菌時間，滅菌后用無菌水沖洗 68次，于MS固體培養(yǎng)基上28 'C避光培養(yǎng)，30 d 后，將愈傷組織進行繼代培 養(yǎng)，得到胚性愈傷組織。2.

4、2農桿菌轉化愈傷組織 用AB固體培養(yǎng)基+氯霉素25 mg/L + 利福平20 mg/L + AS 20 mg/L培養(yǎng)農桿菌，在20 C下培養(yǎng)56 d。用無菌勺子輕輕刮下培養(yǎng)的農桿菌，放入AAM液體培養(yǎng)基中(加有2 mg/L 2，4-D ,0.7 g/L 脯氨酸，20 mg/L AS）, 在80 rpm/min ,27'C下，搖蕩培養(yǎng)4 h。將挑好的胚性愈傷組織放入錐形瓶，菌液倒入另一錐形瓶中，并加入AAM培養(yǎng)基（+AS50mg/L）,分別調節(jié)OD600值至不同數(shù)值（0. 120、0. 145 、0. 158 、0. 190 、0. 195） , 以確定最佳的發(fā)桿菌濃度。然后將菌液倒入愈

5、傷組織中 , 用手 輕搖，感染15 min。再吸干菌液，將愈傷組織放入裝有濾紙的培養(yǎng)皿中干燥，移至共培養(yǎng)基上27 C下共培養(yǎng)34 d。2.3轉化體的獲得將共培養(yǎng)的愈傷組織轉出，無菌水漂洗34次，再用NB培養(yǎng)基+ 50 mg/L 頭抱霉素在室溫下100 rpm搖洗12 h，洗2遍后吸干放在濾紙上。將吸干的愈傷組織轉入N6選擇培養(yǎng)基上（+ 50 mg/L 潮霉素+ 500 mg/L 頭抱霉素），27 C下暗培養(yǎng)20 d后，繼代一次。將新長出的抗性愈傷組 織轉移到N6預分化培養(yǎng)基上，28 C下，暗培養(yǎng)7 d。將抗性愈傷組織轉移到N6分化培養(yǎng)基上，28下，光照12 h/ d，培養(yǎng)23周后，新鮮愈傷組織

6、將有綠點出現(xiàn)，每2周繼代一次，待分化出完整小苗后轉入壯苗培養(yǎng)基MS中。煉苗并移栽。2.4 GUS染色分析參照Jefferson 的方法，切取T0代轉化體的葉片、種子等器官進行染色，在37 C下反應1216 h，棄去染色液，用95 %的酒精脫色，在解剖顯微鏡下觀察拍照。染色液組成為50mM的磷酸鈉鹽緩沖液，pH7.0，10 mMEDTAD. 1 %TritonX- 100，1 mg/ml 的 X - Glue，0. 1 mM鐵氰化鉀，0.1mM亞鐵氰化鉀，20 %甲醇。3 結果與分析3.1 不同滅菌時間對愈傷誘導率的影響 滅菌是轉化成功的關鍵技術之一 ， 既要保證滅菌徹底 ， 又不能影 響種子萌

7、發(fā)和產生愈傷。用 2.5 % 次氯酸鈉對 200 粒種子分別處理 40 min 、 37 min 、 30min 和 25 min ， 結果表明 ， 隨著滅菌時間的增加 ， 愈傷誘導率呈下降趨勢。滅菌 40 min 時 ， 愈傷誘導率僅為 77 %，大部 分種子不能萌發(fā) ， 推測可能是胚已被到滅菌效果 ， 次氯酸鈉對種子萌發(fā)無影響 ， 種子萌發(fā)力強 ， 但是由于 萌發(fā)消耗了很多養(yǎng)分 ， 反而部分抑制了愈傷組織的生長 ， 故其愈傷誘導率為 96.3 %， 反而低于滅菌 30 min 時的愈傷誘導率 97.3 % 。而且 ， 滅菌 40 min 和 37 min 時 ， 形成的愈傷顆粒比較小 ，

8、侵染時易于褐死 ， 不利于轉化，而滅菌30 min時的愈傷顆粒大小在 3 mm左右，適合于轉化，且誘導率最高。因此，2. 5 % 次氯酸鈉的最適滅菌時間為 30min 。3.2 愈傷組織的繼代培養(yǎng)時間對轉化率的影響 愈傷組織經過多代培養(yǎng)后 ， 會產生體細胞突變 ， 不利于轉化體的篩選。同時 ， 多代培養(yǎng)后 ， 愈傷組織逐漸衰老死亡 ， 將大大降低轉化效率。但是傳統(tǒng)的方法直接用 誘導的愈傷來轉化 ， 也會降低轉化效率 ， 這可能是細胞的周期狀態(tài)影響了轉化效率 ， 有報道認為當愈傷組 織細胞處于細胞周期 S時期和G2周9期的比例高時轉化效率最高，而且S期是細胞DNA復制期，此時轉化有利于 T- 鏈

9、轉變成雙鏈 ， 增加穩(wěn)定整合和遺傳。所以經過適當?shù)睦^代培養(yǎng) ， 可以使細胞處于轉化最 佳狀態(tài)而提高轉化效率。本實驗通過觀察 ， 經繼代培養(yǎng)后的愈傷組織表面光滑 ， 質地致密 ， 粒形好 ， 繼代培養(yǎng)67d時轉化率最高。培養(yǎng)時間太短，愈傷組織表面粗糙，粒小，不利于轉化；培養(yǎng)時間過長則愈傷組織變軟 , 發(fā)粘 , 轉化后易褐化死亡。3.3 農桿菌濃度對轉化效率的影響 農桿菌濃度直接影響到轉化效率。農桿菌濃度太低時 ， 每個愈傷組織 塊產生的抗性愈傷數(shù)極少 ， 大部分不產生抗性愈傷 ； 濃度太高 ， 則愈傷組織很容易被過度侵染 ， 共培養(yǎng)后 無法恢復活力 ， 在進行選擇培養(yǎng)時 ， 大多數(shù)會褐化死亡。本

10、研究用不同 OD 值的農桿菌菌液分別處理生長 狀況良好一致的300個愈傷組織，發(fā)現(xiàn)當OD6O0直為0.1450.190時，轉化效率基本保持在 79 %左右, 當0D600值低于0. 145 時，轉化率較低，超過0. 190 時，愈傷死亡數(shù)量增多，并且選擇培養(yǎng)時，因過 多的農桿菌覆蓋在抗性愈傷組織上 ， 抑制了其生長。4 結論與討論農桿菌轉化效率的影響因子包括菌株類型、水稻基因類型、培養(yǎng)基成分組成、組織培養(yǎng)條件等。筆者 通過對日本晴水稻轉化條件的研究，發(fā)現(xiàn)在日本晴的轉化過程中，當種子滅菌30 min時，愈傷的誘導率最高，繼代培養(yǎng)67 d后的轉化率最高，菌濃度0D600值為0. 1450. 190

11、時，轉化效率高。另外，試 驗還發(fā)現(xiàn)在分化培養(yǎng)時 ， 黑暗條件下預培養(yǎng) 7 d 的可以大大減少愈傷組織的褐化程度 ， 分化效率達到 85 %。優(yōu)化后轉化體系大大減少了組織培養(yǎng)時間 ，3 個月即可獲得轉化植株 ， 不但節(jié)省成本 ， 而且減少由 于組培而激活 Tos17 等水稻內源轉座子從而造成體細胞突變的頻率 。農桿菌介導的基因轉化技術已經很成熟 ， 但是要適應高通量的水稻基因組研究 ， 快速完成 T -DNA 插 入飽和突變體的創(chuàng)制 ， 需要大大提高抗性愈傷組織的分化效率。傳統(tǒng)轉化技術將轉化后的愈傷組織直接放 在同一培養(yǎng)基上進行分化與選擇培養(yǎng) ， 容易造成愈傷組織因褐化而抑制分化。因為選擇培養(yǎng)基中含有的高 濃度抗生素使未轉化的愈傷組織褐化而產生酚類等有毒物質 ， 抑制了抗性愈傷組織的生長和分化。有人對 傳統(tǒng)轉化方法進行初步改進 ， 把抗性愈傷組織單獨放在含有抗生素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng) ， 但是由于抗生素 的影響以及分化培養(yǎng)基中的ABA等見光分解，結果直接影響了分化效果。筆者在此基礎上做了進一步的改進 ， 將選擇培養(yǎng)基上的抗性愈傷組織轉到分化培養(yǎng)基上 ， 然后放置在黑暗下培養(yǎng) 7 d ， 再轉到新的分化培 養(yǎng)基上光照下培養(yǎng) ， 只需 10 d 左右就能分化成苗 ， 分化效率可達 85 %。該方法的優(yōu)