重組DNA技術基礎

1、第二章第二章重組技術基礎重組技術基礎DNA組成與結構組成與結構一級結構一級結構 堿基的排列順序堿基的排列順序二級結構二級結構 DNADNA的雙螺旋形式的雙螺旋形式高級結構高級結構 DNADNA的超螺旋形式的超螺旋形式核酸核酸 分子組成分子組成DNA的分子結構的分子結構（一）核酸的分類（一）核酸的分類 90% 90%以上分布于以上分布于細胞核，細胞核，其余分布于其余分布于核外核外如線粒體，葉綠體，質粒等。如線粒體，葉綠體，質粒等。分布于分布于胞核、胞液。胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 核糖

2、核酸核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細胞和個攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的基因型體的基因型(genotype)。參與細胞內參與細胞內DNA遺傳信息的表遺傳信息的表達。某些病毒達。某些病毒RNA也可作為遺也可作為遺傳信息的載體。傳信息的載體。. .戊戊 糖糖（構成（構成RNA）1 2 3 4 5 OHOCH2OHOHOH -D-呋喃核糖呋喃核糖(ribose)（構成（構成DNA）OHOCH2OHOH -D-2-脫氧呋喃脫氧呋喃核糖核糖 (deoxyribose)2. 堿堿 基基嘌呤嘌呤(purine) 嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine, C)尿嘧啶尿嘧啶(uracil,

3、U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T)腺嘌呤腺嘌呤(adenine, A)鳥嘌呤鳥嘌呤(guanine, G)核苷：核苷：AR, GR, UR, CR脫氧核苷：脫氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR3. 核苷核苷(ribonucleoside)堿基堿基核糖（脫氧核糖）核糖（脫氧核糖） 連接方式：連接方式：CN 糖苷鍵糖苷鍵堿基（堿基（9 /1位）位） 戊糖（戊糖（1，位）位） OHOCH2OHOHNNNH2O1 1POOOHOHOCH2OHOHNNNH2O核苷酸：核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脫氧核苷酸：脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP .

4、核苷酸核苷酸(ribonucleotide)核苷（脫氧核苷）核苷（脫氧核苷）磷酸磷酸磷酸酯鍵磷酸酯鍵NOCH2OOHOHNNNNH2POOHOHNOCH2OOHONNNNH2POOH5 端端3 端端. . 核苷酸的連接核苷酸的連接 ，磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵CGA二、核酸的一級結構二、核酸的一級結構定義：定義： 核酸中核苷酸的排列順序核酸中核苷酸的排列順序（堿基序列）（堿基序列）。55端端3端端CGAA G P5 P T PG PC PT P OH 3 書寫方法書寫方法5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 豎式橫式簡化式DNA的空間結構的空間結構一、一、DNA的二

5、級結構的二級結構（一）雙螺旋結構（一）雙螺旋結構DNA雙螺旋結構模型要點雙螺旋結構模型要點 （Watson, Crick, 1953）u兩條兩條DNADNA單鏈分子單鏈分子反向反向平行平行環(huán)繞，環(huán)繞，右手螺旋走向，右手螺旋走向，表面表面大大溝與小溝相間。溝與小溝相間。u螺旋直徑為螺旋直徑為2nm， 主鏈主鏈：戊糖：戊糖 磷酸骨架位于外側磷酸骨架位于外側 側鏈側鏈：堿基對位于內側：堿基對位于內側u堿基平面垂直于螺旋軸堿基平面垂直于螺旋軸 堿基距：堿基距：0.34nm； 螺距螺距： 3.4nm； 周長：周長：1 0對堿基對堿基。u堿基形成堿基形成氫鍵配對氫鍵配對，配對形，配對形式為：式為：A=T;

6、 G C） 。堿基互補配對堿基互補配對 u穩(wěn)定因素：穩(wěn)定因素：1. 1.氫鍵氫鍵維持維持橫向穩(wěn)定性橫向穩(wěn)定性，2. 2.堿基堆積力堿基堆積力維持維持縱向穩(wěn)定縱向穩(wěn)定性性。3.介質中陽離子可以有效地介質中陽離子可以有效地屏蔽磷酸基之間的靜電斥力屏蔽磷酸基之間的靜電斥力 DNA雙螺旋結構的多樣性雙螺旋結構的多樣性A型B型型（二）與（二）與DNA堿基順序相關的特殊結構堿基順序相關的特殊結構 堿基順序顛倒重復而具有堿基順序顛倒重復而具有2倍對稱的倍對稱的DNA段落段落 鏡像重復序列鏡像重復序列 tsDNA是在DNA雙螺旋結構的基礎上形成的，三條鏈均為同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（

7、homopyrimidine，Hpy），即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。（三）三股螺旋（三）三股螺旋DNA（tsDNA,也稱也稱H-DNA ） Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中穩(wěn)定，較多見較多見 1NNOOCH3CHNNNNNHHHCNNOOH3CCHH111TTAT=ANNNONNNNONCHHHHHNNNOCHHHCGC+TCG C1C1NNOOCH3CHNNNNNHHHC11TAT=A ANNNNNHHC1A1NNNONNNNONCHHHHHCGCG GC1NNNNONHHGCH1Hoogsteen堿基配對堿基配對 (四四)四螺旋四螺旋DNA G四堿基體結構示意圖四堿基體結構示意圖 四螺旋

8、DNA的生物學意義 真核染色體末端含有一個富含G的單鏈DNA尾巴?？勺陨砘卣坌纬蒆oogsteen G-G堿基對。 兩個DNA分子(染色體)可彼此連接，形成一個局部四螺旋結構，這種結構起著穩(wěn)定染色穩(wěn)定染色體體和在復制過程中保持其完整性完整性的作用。 (五五) 酶活性酶活性DNA 1995年Cuenoud等發(fā)現(xiàn)了具有酶活性的DNA，再次豐富了酶學。 Cuenoud根據(jù)共有序列設計并合成了由47個核苷酸組成的單鏈DNA-E47，以此連接兩個底物DNAS1和S2 二、二、DNA的超螺旋結構及其在染色質的超螺旋結構及其在染色質中的組裝中的組裝（一）（一）DNA的超螺旋結構的超螺旋結構超螺旋結構超螺旋結

9、構(superhelix 或或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結構。雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結構。 正超螺旋正超螺旋(positive supercoil)盤繞方向與盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同雙螺旋方同相同 負超螺旋負超螺旋(negative supercoil)盤繞方向與盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反雙螺旋方向相反 意義意義DNA超螺旋結構整體或局部的拓撲學超螺旋結構整體或局部的拓撲學變化及其變化及其調控調控對于對于DNA復制和復制和RNA轉錄過轉錄過程程具有關鍵作用。具有關鍵作用。 （二）原核生物（二）原核生物DNA的高級結構的高級結構（三）（三）DNA在真核生物

10、細胞核內的組裝在真核生物細胞核內的組裝真核生物染色體由真核生物染色體由DNA和蛋白質構成，和蛋白質構成，其基本單位是其基本單位是 核小體核小體(nucleosome)。 DNA：約約200bp 組蛋白：組蛋白：H1 , H2A, H2B, H3, H4核小體的化學組成核小體的化學組成RNA的結構的結構Structure of RNARNA的種類、分布、功能的種類、分布、功能核蛋白體核蛋白體RNA信使信使RNA轉運轉運RNA核內不均一核內不均一RNA核內小核內小RNA胞漿小胞漿小RNA 細胞核和胞液細胞核和胞液線粒體線粒體功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRN

11、AHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分核蛋白體組分蛋白質合成模板蛋白質合成模板轉運氨基酸轉運氨基酸成熟成熟mRNA的前體的前體參與參與hnRNA的剪接、轉運的剪接、轉運rRNA的加工、修飾的加工、修飾蛋白質內質網(wǎng)定位合成蛋白質內質網(wǎng)定位合成的信號識別體的組分的信號識別體的組分核仁小核仁小RNA核蛋白體核蛋白體RNA信使信使RNA轉運轉運RNA核內不均一核內不均一RNA核內小核內小RNA胞漿小胞漿小RNA 細胞核和胞液細胞核和胞液線粒體線粒體功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/

12、7SL-RNA 核蛋白體組分核蛋白體組分蛋白質合成模板蛋白質合成模板轉運氨基酸轉運氨基酸成熟成熟mRNA的前體的前體參與參與hnRNA的剪接、轉運的剪接、轉運rRNA的加工、修飾的加工、修飾蛋白質內質網(wǎng)定位合成蛋白質內質網(wǎng)定位合成的信號識別體的組分的信號識別體的組分核仁小核仁小RNAmRNArRNAtRNA一一 、mRNA的結構與功能的結構與功能hnRNA 內含子內含子( (intron) )mRNA 外顯子外顯子( (exon) )* * 真核細胞真核細胞mRNA結構特點結構特點1. 5 末端有甲基化鳥苷帽子結構：末端有甲基化鳥苷帽子結構：m7GpppNm- 2. 3 末端有多聚腺苷酸尾巴：

13、末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。帽子結構帽子結構促進促進mRNA由胞核向胞質的轉位由胞核向胞質的轉位維持維持mRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性翻譯起始的調控翻譯起始的調控 帽子結構和多聚帽子結構和多聚A尾的功能尾的功能* mRNA的功能的功能 把把DNA的堿基序列翻譯的堿基序列翻譯成蛋白質的氨成蛋白質的氨基酸順序?；犴樞颉NAmRNA蛋白蛋白轉錄轉錄翻譯翻譯原核細胞原核細胞 細胞質細胞質細胞核細胞核DNA內含子內含子外顯子外顯子轉錄轉錄轉錄后剪接轉錄后剪接轉運轉運mRNAhnRNA翻譯翻譯蛋白蛋白真核細胞真核細胞 * tRNA的一級結構特點的一級結構特點 含含 1020% 稀有堿基，如稀有堿基，如

14、 DHU 3 末端為末端為 CCA-OH 5 末端大多數(shù)為末端大多數(shù)為G 具有具有 T C 二、轉運二、轉運RNA的結構與功能的結構與功能NNHNHNNOCH3CH3NNNHNNHCH2CHCCH3CH3NHNHOOHHHHNHNHSON,N-二甲基鳥嘌呤二甲基鳥嘌呤N6-異戊烯腺嘌呤異戊烯腺嘌呤雙氫尿嘧啶雙氫尿嘧啶（DHU）4-巰尿嘧啶巰尿嘧啶 稀有堿基稀有堿基 * tRNA的二級結構的二級結構三葉草形三葉草形 氨基酸臂氨基酸臂 DHU環(huán)環(huán) 反密碼環(huán)反密碼環(huán) 額外環(huán)額外環(huán) TC環(huán)環(huán)氨基酸氨基酸臂臂額外環(huán)額外環(huán)* tRNA的三級結構的三級結構 倒倒L形形* tRNA的功能的功能活化、搬運氨基活

15、化、搬運氨基酸到核糖體，參與蛋酸到核糖體，參與蛋白質的翻譯。白質的翻譯。* rRNA的結構的結構三、三、rRNA的結構與功能的結構與功能* rRNA的功能的功能參與組成核蛋白參與組成核蛋白體，作為蛋白質生物體，作為蛋白質生物合成的場所。合成的場所。 rRNA的種類的種類真核生物真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNAS（沉降系數(shù)）：沉降系數(shù)）：單位時間內的單位時間內的沉降沉降速度速度核核 酸酸 的的 理理 化化 性性 質質The Physical and Chemical Characters of

16、Nucleic Acid1. 核酸的核酸的溶解度溶解度核酸是極性分子，微溶于水核酸是極性分子，微溶于水，不溶于乙醇或異丙，不溶于乙醇或異丙醇。醇。DNA+蛋白質蛋白質脫氧核糖核蛋白（脫氧核糖核蛋白（DNP）：）： 在在1 mol/L的的NaCl溶液中的溶解度最大。溶液中的溶解度最大。RNA+ +蛋白質蛋白質核糖核蛋白（核糖核蛋白（RNP）：）：在在0.14 mol/L的的NaCl溶液中的溶解度最大。溶液中的溶解度最大。一、核酸的一般理化性質一、核酸的一般理化性質 核酸屬于兩性電解質，但因為磷酸的核酸屬于兩性電解質，但因為磷酸的酸性較強，因此總體呈現(xiàn)酸性較強，因此總體呈現(xiàn)較強的酸性較強的酸性。具

17、有較低的等電點。當溶液的具有較低的等電點。當溶液的pH 4時，時，呈多呈多負離子負離子狀態(tài)，容易與金屬離子結狀態(tài)，容易與金屬離子結合形成鹽。合形成鹽。3. 核酸核酸的高分子性質的高分子性質粘度：粘度： DNARNA dsDNA ssDNA4. 核酸核酸的紫外吸收的紫外吸收(OD260)單核苷酸單核苷酸 ssDNA(或或RNA) dsDNA5.核酸的化學性質 核酸中的嘌呤和嘧啶能進行脫氨、聚合、脫氨、聚合、烷基化烷基化等反應等。脫氨：脫氨：CUCU脫氨：脫氨：CUCUA AT T C C G GA AA AT TT TG G C CA AT T U U G GA AA AT TT TA AC C

18、千萬年后，千萬年后，G GC C 將不復存在將不復存在 l聚合聚合 紫外光誘導兩個相鄰嘧啶之間形成二聚體紫外光誘導兩個相鄰嘧啶之間形成二聚體CH3NHNOOCH3NHNOORRPPPCH3NHNOOCH3NHNOORRPPP紫外光圖3-25 胸腺嘧啶二聚體的形成二、二、DNA的變性的變性(denaturation)定義定義：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開雙鏈解開成兩條單鏈的過程。成兩條單鏈的過程。方法：方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、 酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質

19、變化：變性后其它理化性質變化：OD260增高增高粘度下降粘度下降浮力密度升高浮力密度升高 酸堿滴定曲線改變酸堿滴定曲線改變生物活性喪失生物活性喪失DNADNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜的紫外吸收光譜增色效應：增色效應：DNA變性時其溶液變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。增高的現(xiàn)象。解鏈曲線：解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱如果在連續(xù)加熱DNADNA的過程中以的過程中以溫度對溫度對A260A260（absorbanceabsorbance，A A，A260A260代表溶液在代表溶液在260nm260

20、nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線鏈曲線。 Tm：DNA變性時變性時紫外光吸收值達到紫外光吸收值達到最大值的最大值的50%時的時的溫度稱為溫度稱為DNA的解的解鏈溫度，又稱融解鏈溫度，又稱融解溫 度溫 度 ( m e l t i n g temperature, Tm)。l影響影響Tm的因素：的因素： 1. G+C含量含量: G+C越高，越高，Tm 越高越高 2. DNA樣品均一性：樣品均一性： 均一的均一的DNADNA樣品，樣品，Tm范圍較狹窄。范圍較狹窄。 3.3.核酸的種類：核酸的種類： 雙鏈雙鏈RNA RNA RNA-DNARNA-DNA

21、雜交鏈雜交鏈 DNADNA雙鏈雙鏈 4.4.溶液的離子強度溶液的離子強度 ： 離子強度高，離子強度高，TmTm值高值高 。三、三、DNA的復性與分子雜交的復性與分子雜交 DNA復性復性(renaturation)的定義的定義在適當條件下，變性在適當條件下，變性DNADNA的兩條互補鏈可的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現(xiàn)象稱為恢復天然的雙螺旋構象，這一現(xiàn)象稱為復性復性。減色效應減色效應 DNA復性時，其溶液復性時，其溶液OD260降低的現(xiàn)象。降低的現(xiàn)象。熱變性的熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為這一過程稱為退火退火(annealing) 。不同來源的核

22、酸鏈分子復性時形成雜化雙鏈過不同來源的核酸鏈分子復性時形成雜化雙鏈過程叫分子雜交。程叫分子雜交。這種雜化雙鏈可以在不同的這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與與DNA之間形成，也可以在之間形成，也可以在DNA和和RNA分子間或者分子間或者RNA與與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。分子雜交。核酸分子雜交核酸分子雜交(hybridization) DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復性復性 不同來源的不同來源的DNA分子分子核酸分子雜交的應用核酸分子雜交的應用l研究研究DNA分子中某一種基因的位置分子中某一種基因的位置l確定兩種核酸分子間的序列相似性確定兩種