蛋白酶活力的測定

1、實驗三 蛋白酶活力的測定一、目的掌握用分光光度計法測定蛋白酶活力的原理與操作技術。二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其產物酪氨酸能在堿性條件下使福林酚試劑還原，生成鉬藍與鎢藍，以比色法測定。三、試劑及儀器1 福林酚試劑稱取50g鎢酸鈉(Na2WO42H2O)，12.5g鉬酸鈉(Na2MoO42H2O)，置入1000mL原底燒瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL濃鹽酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸鋰(Li2SO4)和25mL水，混勻后，加溴水脫色，直至溶液呈金黃色，再微沸15min，驅除殘余的溴，冷卻，用4號耐酸玻璃過濾器抽濾，濾液用水稀釋至500mL。使用時用2倍體積

2、的水稀釋。2 0.4mol/L碳酸鈉溶液：稱取42.4g碳酸鈉，用水溶解并定容至1000mL。3 0.4mol/L三氯乙酸溶液：稱取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。4 2%酪蛋白溶液 稱取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加約40mL水和23滴濃氨水，于沸水浴中加熱溶解，冷卻后，用pH7.2磷酸緩沖溶液稀釋定容至100mL，貯存于冰箱中。5 pH7.2磷酸緩沖液 0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液：稱取31.2g磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O)，用水溶解稀釋至1000mL；0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：稱取71.6g磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)，用水溶解稀釋至1

3、000mL； pH7.2磷酸緩沖溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，用水稀釋至1000mL。6 標準酪氨酸溶液：準確稱取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L鹽酸溶液(取1.7mL濃鹽酸，用水稀釋至100mL)，加熱溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。7 儀器：分光光度計、試管四、操作步驟1 標準曲線繪制取9支試管，按下表將標準酪氨酸溶液稀釋。編 號012345678標準酪氨酸溶液 (mL)100 mg/mL012345678水 (mL)1098765432稀釋酪氨酸溶液濃度 (mg/mL)0102030

4、4050607080在上述各管中各取1mL，分別加入5mL 0.4mol/L碳酸鈉溶液，1mL福林酚試劑，于400C水浴顯色20min，在680nm波長下測吸光度，繪制標準曲線，在標準曲線上求得吸光度為1時相當的酪氨酸mg數，即為K值。2 酶液的制備 準確稱取酶粉0.5g，用pH7.2磷酸緩沖溶液定容至100mL，置入400C水浴浸取0.5h，用紗布過濾。根據酶活力的高低，再用pH7.2磷酸緩沖溶液稀釋一定倍數(使其測定的吸光度在0.20.4范圍內為宜，約4-5倍)。3 測定 取一支離心管，加入1mL稀釋酶液，置入400C水浴中預熱35min，再加入預熱至400C 的2%酪蛋白溶液1mL，準確

5、及時保溫10min。立即加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，15min后離心分離或用濾紙過濾。吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸鈉溶液，最后加入1mL福林酚試劑，搖勻，于400C水浴中顯色20min。 另取一支離心管為空白管。在空白管中先加入1mL稀釋酶液，再加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加1mL2% 酪蛋白溶液，15min后離心分離或用濾紙過濾。吸取1mL清液，加5mL 0.4mol/L碳酸鈉溶液，最后加入1mL福林酚試劑，搖勻，于400C水浴中顯色20min。以空白為對照，在680nm波長下測吸光度。4.計算蛋白酶活力單位的定義：1g酶粉，在400C，pH7.2下

6、，每分鐘水解酪蛋白為酪氨酸的微克(mg)數。蛋白酶活力 = 式中： E試管的吸光度 4離心管中反應液的總體積，mL 10反應10min N稀釋倍數 W酶粉稱取量，g K為Y=1時X的值 即1.14結果與分析：OD680CK 1 2 30 3.85 2.05 3.71表面上看2號樣的數據看似很有可以于是從上面的表格分析，平均的習慣值為 樣品標準誤差為根據格拉布斯法則來判斷樣品2數據是否舍去。1Xp=質疑的數據=平均值為置信水平N為樣品數S為樣品標準誤差 所以樣品2的數據屬于正常范圍內。即在處理數據的時候不應該將樣品2忽略舍去。于是樣品的酶的活力。樣品1酶活力為702.24樣品2酶活力為373.92樣品3酶活力為676.704平均酶活力為： 584.288從上述的實驗，樣品2的波動的原因可以歸結為一、有可能是在酶液移液的時候有過多的損失而造成了酶活力很少的偏差 二