咪唑乙煙酸高效降解細(xì)菌的篩選及其原生質(zhì)體制備的研究(完成)

1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 學(xué)號(hào)：A03050160咪唑乙煙酸高效降解細(xì)菌的篩選及其原生質(zhì)體制備的研究學(xué)生姓名：王任指導(dǎo)教師：李春艷 教授所在院系：資源與環(huán)境學(xué)院所學(xué)專業(yè)：生物技術(shù)研究方向：應(yīng)用微生物東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué)中國(guó)哈爾濱2010 年 5 月Dissertation for Bachelors Degree of Mrtheart Agricultural University NO.：A03050160Study on the Screening of Imazethapyr Degradation Bacteria and Protoplast PreparationCandida

2、te: Wang RenSupervisor: Pro. Li ChunyanCollege: Resources Environment collegeSpeciality: BiotechnologyOrientation: Applied MicrobiologyNortheast Agricultural UniversityHarbin ChinaMay. 2010摘要除草劑咪唑乙煙酸是咪唑琳酮類性除草劑。咪唑乙煙酸具有殺草譜廣、選擇性強(qiáng)、活性高等優(yōu)點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。自從1993年咪唑乙煙酸國(guó)產(chǎn)化，成本下降，用量大幅增加，在我國(guó)大豆產(chǎn)區(qū)得到大面積的推廣和應(yīng)用。咪唑乙煙酸殘

3、效期長(zhǎng)，使下茬敏感作物容易產(chǎn)生藥害，因此其在土壤中的歸趨行為越來越引起重視。原生質(zhì)是有組織的生活物質(zhì)，是細(xì)胞生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。原生質(zhì)體是由原生質(zhì)特化而來。原生質(zhì)體技術(shù)的關(guān)鍵是對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行消化，以形成大量的原生質(zhì)體，并使原生質(zhì)體能高頻率的再生細(xì)胞壁，回復(fù)到正常細(xì)胞狀態(tài)。本文利用富集馴化技術(shù)從長(zhǎng)期生產(chǎn)咪唑乙煙酸的農(nóng)藥廠排污口處污泥及污水中馴化培養(yǎng)得到能夠降解咪唑乙煙酸的細(xì)菌1株, 標(biāo)記為P310-1，該菌株能夠以咪唑乙煙酸為唯一碳源穩(wěn)定生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)方法制備篩選所得的降解菌的原生質(zhì)體，經(jīng)測(cè)定，當(dāng)穩(wěn)定劑為pH6.5、再生培養(yǎng)基的pH為7.5時(shí)，菌株P(guān)310-1原生質(zhì)體制備及再生的最佳條件為：

4、溶菌酶濃度、溫度、酶解時(shí)間條件為：2.9 mg/ mL、35、3.50 h。并采用藥敏片方法測(cè)定降解菌的抗藥性，并將其作為遺傳標(biāo)記，為對(duì)降解菌的后續(xù)原生質(zhì)體融合研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。關(guān)鍵詞：咪唑乙煙酸；降解菌；分離；原生質(zhì)體制備AbstractHerbicide imazethapyr is the imidazolinone herbicide. Imazethapyr is a one of broad spectrum herbicides, also has high selectivity and high activity, therefore it had been widely u

5、sed around the world. Since 1993, the imazethapyr has been localization, and its cost has reduced, application amount has increased, it began to get the promotion and application of large area in Soybean producing areas of our country. The longer residual period of imazethapyr could make drug misadv

6、enture for sensitive crops, so the fate of its in the soil has been more and more attention.Archoplasm is the organizational living material, is the the material basis of cell vital movement, all the archoplasm has the similar basic components and characteristics. Protoplast is specializationed from

7、 the archoplasm. The key of protoplast technology is to digest the cell wall to form a large number of the protoplasts, and to make protoplast can regeneration cell wall altofrequently, so that to back to the normal cell state. In this paper, the bacteria 1 degrading imazethapyr can be acquired from

8、 the sludge and sewage in the long-term producting-imazethapyr factory by enrichment acclimation technique, labeled as P310-1, this bacteria can be stabilizly live with imazethapyr as the sole carbon.In this study, the protoplasts degradation bacteria prepared by chemical screening was determined th

9、at when the stabilizer is pH6.5 and regeneration medium pH was 7.5, protoplast preparation and regeneration optimum conditions of Strain P310-1: lysozyme concentration, tempera- ture, reaction time conditions were: 2.9 mg / mL、 35 、 3.50h.And the drug resistance of degradation bacteria was determine

10、d by using susceptibility test, and as genetic markers for providing the research test data on study of the subsequent of degradation bacteria protoplast fusion.Key words: imazethapyr ; degradation bacteria; screen; protoplast preparation目錄摘要IAbstractII1 前言11.1 咪唑啉酮類除草劑的發(fā)展概況11.1.1 咪唑啉酮類除草劑的應(yīng)用11.1.2

11、咪唑啉酮類除草劑作為長(zhǎng)殘效除草劑的危害11.1.3 治理生物降解菌的優(yōu)點(diǎn)11.2 咪唑乙煙酸的簡(jiǎn)介11.2.1 理化性質(zhì)11.3 生物修復(fù)21.3.1 生物修復(fù)的定義、分類，微生物修復(fù)21.3.2 微生物降解農(nóng)藥的研究21.3.3 基因工程菌在微生物降解、生物修復(fù)中的應(yīng)用31.4 原生質(zhì)體融合的研究進(jìn)展31.4.1 定義、原理、應(yīng)用方向31.4.2 構(gòu)建方法、影響因素31.4.3 原生質(zhì)體融合在微生物降解中的應(yīng)用41.5 本研究的目的及意義42 材料與方法62.1 試驗(yàn)材料62.1.1 試驗(yàn)儀器62.1.2 試驗(yàn)藥品及試劑62.1.3 試驗(yàn)培養(yǎng)基的配制72.2試樣采集72.2.1 試樣來源72

12、.2.2 試樣采集72.3 降解菌的馴化與分離純化82.4 回接試驗(yàn)及高效降解菌篩選82.5 降解菌株的形態(tài)學(xué)觀察82.5.1 降解菌菌體形態(tài)的觀察82.5.2 降解菌菌落形態(tài)的觀察82.5.3 降解菌液體培養(yǎng)觀察82.6 降解菌株原生質(zhì)體制備及再生影響因素的研究92.6.1 降解菌株P(guān)310-1遺傳標(biāo)記篩選92.6.2 菌株P(guān)310-1原生質(zhì)體的制備及再生93 結(jié)果與分析123.1 咪唑乙煙酸降解菌株的篩選123.2 降解菌株原生質(zhì)體制備及再生的研究123.2.1 降解菌株P(guān)310-1遺傳標(biāo)記篩選123.2.2 降解菌株D310-1生長(zhǎng)曲線繪制133.2.3 菌株P(guān)310-1原生質(zhì)體制備及再

13、生影響因素分析144 討論164.1 咪唑乙煙酸降解菌的篩選164.2 降解菌P310-1原生質(zhì)體制備及再生影響因素165 結(jié)論18參考文獻(xiàn)19致謝211 前言1.1 咪唑啉酮類除草劑的發(fā)展概況1.1.1 咪唑啉酮類除草劑的應(yīng)用咪唑啉酮類除草劑是20世紀(jì)80年代美國(guó)氰胺公司發(fā)現(xiàn)的一類超高效除草劑。主要用于大豆、花生、蔬菜等旱田作物，防除眾多的一年生和多年生禾本科雜草以及闊葉雜草、莎草科雜草等。咪唑啉酮類除草劑的作用機(jī)理是：這類除草劑是乙酰乳酸合成酶（ALS）或乙酰羥酸合成酶（AHAs）的抑制劑，即通過根、莖、葉吸收，并在木質(zhì)部和韌皮部傳導(dǎo)，積累于植物分生組織內(nèi)，抑制植物的乙酰乳酸合成酶，阻止支

14、鏈氨基酸，如頡氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成，從而破壞蛋白質(zhì)的合成，干擾DNA合成及細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng)，最終造成植株死亡。1.1.2 咪唑啉酮類除草劑作為長(zhǎng)殘效除草劑的危害咪唑啉酮類除草劑作為一種長(zhǎng)殘效除草劑很難分解。比如我國(guó)北方地區(qū)的寒冷氣候條件使土壤中長(zhǎng)殘效除草劑很難在短時(shí)間內(nèi)降解。嚴(yán)重影響了種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和換茬輪作，南方多季種植結(jié)構(gòu)仍會(huì)造成除草劑的殘留藥害。因此有關(guān)長(zhǎng)殘效除草劑的危害問題日趨嚴(yán)重。1.1.3 治理生物降解菌的優(yōu)點(diǎn)生物降解菌在處理長(zhǎng)殘效除草劑的危害方面具有速度快、消耗低、效率高、條件溫和，無(wú)二次污染、對(duì)環(huán)境友好等顯著優(yōu)點(diǎn)，為從根本上解決長(zhǎng)殘效除草劑的危害問題提供了無(wú)限的希望

15、。1.2 咪唑乙煙酸的簡(jiǎn)介1.2.1 理化性質(zhì)咪唑乙煙酸，通用名稱咪草煙(imazethapyr)，純品外觀為白色無(wú)味結(jié)晶體，熔點(diǎn)172750.蒸汽壓15 mm強(qiáng)抑制作用，由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知：利福平、替考拉寧、頭孢噻吩、苯唑青霉素、呋喃妥因?qū)310-1無(wú)作用，依諾沙星、多粘菌素B有弱作用，試驗(yàn)范圍內(nèi)的其他抗生素均有強(qiáng)抑制作用；3.2.2 降解菌株D310-1生長(zhǎng)曲線繪制 按照2.6.2.1操作獲得降解菌株P(guān)310-1的生長(zhǎng)周期分布，見圖3-2。由圖可知，菌株P(guān)310-1在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長(zhǎng)迅速，30 h后即可進(jìn)入穩(wěn)定期，按照延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰減期時(shí)間分布選擇適合原生質(zhì)體試驗(yàn)

16、的生理狀態(tài)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。圖3-2 降解菌株P(guān)310-1生長(zhǎng)曲線3.2.3 菌株P(guān)310-1原生質(zhì)體制備及再生影響因素分析 3.2.3.1 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響在本試驗(yàn)中，菌株P(guān)310-1菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中、后期（穩(wěn)定期初期）時(shí)菌體破壁及再生效果接近，后期效果略好于中期，明顯優(yōu)于初期。表3-3 不同菌齡的破壁及再生效果初始OD600值菌株P(guān)310-1破壁率%再生率%破壁率再生率1.810051.280.511.699.8849.940.501.310044.830.453.2.3.2 穩(wěn)定劑配比及其pH值對(duì)菌株P(guān)310-1原生質(zhì)體釋放的影響按照2.6.2.3（2）中所列的穩(wěn)定劑配比范圍

17、，進(jìn)行組合，逐一檢測(cè)，測(cè)得出發(fā)菌株的原生質(zhì)體各破壁和再生率。試驗(yàn)結(jié)果證明0.55 M蔗糖+0.02 M MgCl26H2O為最佳組合，兩株菌的破壁率大于80%，破壁率再生率均大于0.5。穩(wěn)定劑pH值對(duì)菌株P(guān)310-1原生質(zhì)體制備和再生的影響較大（表3-4），在穩(wěn)定劑為pH6.5時(shí)，菌株P(guān)310-1的破壁率再生率達(dá)0.72，破壁率84.33%。表3-4 不同pH值對(duì)破壁及再生的影響初始pH值菌株P(guān)310-1破壁率%再生率%破壁率再生率684.8280.270.686.584.3385.830.72779.3774.990.607.580.8573.330.593.2.3.3 再生培養(yǎng)基及其pH值

18、對(duì)菌株P(guān)310-1原生質(zhì)體再生的影響由表3-5可以看出，菌株P(guān)310-1的原生質(zhì)體在5種再生培養(yǎng)基上都可以生長(zhǎng)，但在MNP上再生長(zhǎng)量很少；完全培養(yǎng)基中進(jìn)行再生培養(yǎng)時(shí)，不易形成單菌落現(xiàn)象；完全培養(yǎng)基中再生培養(yǎng)，菌落較小，且生長(zhǎng)時(shí)間較完全培養(yǎng)基中長(zhǎng)；完全培養(yǎng)基中再生株菌生長(zhǎng)較分散、菌落相對(duì)較小，2-3 d可完成再生培養(yǎng)，菌株P(guān)310-1可在完全培養(yǎng)基中良好再生原因可能在于此培養(yǎng)基中主要成分是蔗糖，而細(xì)菌、放線菌中多數(shù)菌采用糖系統(tǒng)作穩(wěn)定劑。表3-5 不同培養(yǎng)基對(duì)再生的影響培養(yǎng)基菌株P(guān)310-1MNP MNP 完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基注：“”表示再生菌株較多，效果明顯，“”表示有再生菌株，“”再

19、生菌株較少由再生培養(yǎng)基pH值對(duì)原生質(zhì)體再生影響的試驗(yàn)顯示：菌株P(guān)310-1形成的原生質(zhì)體在pH6的再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)效果不滿足實(shí)驗(yàn)要求，pH7.0與7.5 效果一致，綜合考慮，確定再生培養(yǎng)基的pH為7.5。3.2.3.4 酶解濃度、時(shí)間、溫度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響溶菌酶的濃度、作用時(shí)間及作用溫度是菌體原生質(zhì)體釋放、再生的關(guān)鍵，是影響原生質(zhì)體融合的主要因素。隨著溶菌酶濃度的增加，原生質(zhì)體化程度會(huì)增加，但過量的酶作用，會(huì)造成細(xì)胞壁去除過于徹底，缺少細(xì)胞壁再生的引物，會(huì)導(dǎo)致再生率降低；酶濃度過大也會(huì)引起菌體凝聚成團(tuán)，降低菌酶接觸面積，不利于原生質(zhì)體的制備；酶解時(shí)間短，酶解不徹底，酶解時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞壁

20、溶解的徹底，但過長(zhǎng)時(shí)間，溶菌酶繼續(xù)作用原生質(zhì)體，致其損傷、破裂，無(wú)法再生；酶解溫度適宜，使酶活性完全發(fā)揮，利于酶解反應(yīng)，但如果酶解溫度過高，溶菌酶鈍化、失活，溫度過低，會(huì)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，影響試驗(yàn)進(jìn)程。由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，在酶解過程中溶菌酶的濃度、作用時(shí)間及作用溫度對(duì)對(duì)原生質(zhì)體制備及再生影響是相互關(guān)聯(lián)的，試驗(yàn)中將作綜合考慮，結(jié)果見表3-6。表3-6 菌株原生質(zhì)體制備正交試驗(yàn)結(jié)果列號(hào)因素1因素2因素3破壁率再生率11110.5421220.5431330.7242130.7052210.5262320.6873120.6683230.4993310.58均值10.6000.6330.547均值20.633

21、0.5170.627均值30.5770.6600.637極差0.0560.1430.090由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，在酶解過程中溶菌酶的濃度、作用時(shí)間及作用溫度對(duì)原生質(zhì)體制備及再生的影響是有相互影響的，綜合考慮進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3-6。由各因素均值分析可知：菌株P(guān)310-1破壁及再生最佳組合條件為A2B3C3，即最佳條件配比為：酶解37、作用時(shí)間3.50 h、加溶菌酶2.9 mg/mL，根據(jù)極差分析各因素對(duì)破壁及再生影響大小順序依次為：溶菌酶作用溫度作用時(shí)間酶濃度。4 討論4.1 咪唑乙煙酸降解菌的篩選本試驗(yàn)采取液體富集培養(yǎng)方法，以長(zhǎng)期使用長(zhǎng)殘留除草劑咪唑乙煙酸的土壤為分離源，以咪唑乙煙酸為目標(biāo)菌株生

22、長(zhǎng)的限制性底物，并逐漸提高選擇壓(增加咪唑乙煙酸的濃度)來誘導(dǎo)菌株的適應(yīng)能力，經(jīng)長(zhǎng)期的液體富集培養(yǎng)，然后在含藥的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中進(jìn)行篩選，在這種選擇壓力的作用下，淘汰不適應(yīng)的菌群，適應(yīng)的生存下來，并逐漸增強(qiáng)了其適應(yīng)能力，即可分離、純化出可降解咪哇乙煙酸的高效菌株。制備土壤浸出液時(shí)，直接在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入低濃度的農(nóng)藥，一方面利于選擇，因?yàn)槟繕?biāo)菌能利用農(nóng)藥作為碳源和氮源在不含外源碳源和氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而其他菌種由于缺少能源，不能生長(zhǎng)。另一方面，在不斷更換新鮮培養(yǎng)基加大稀釋倍數(shù)的同時(shí)，也要加大農(nóng)藥的濃度，使菌種逐步被分離且性狀穩(wěn)定。 保存菌種時(shí)，需始終維持底物（咪唑乙煙酸）含量，避免篩選獲得菌株的

23、降解能力的退化。 4.2 降解菌P310-1原生質(zhì)體制備及再生影響因素 本試驗(yàn)是設(shè)定其他條件一定的情況下試驗(yàn)其他條件對(duì)咪唑乙煙酸降解菌株原生質(zhì)體制備及再生條件進(jìn)行測(cè)定的。原生質(zhì)體由于失去細(xì)胞壁，失去了保護(hù)作用，細(xì)胞對(duì)外界條件反應(yīng)敏感，尤其是滲透壓，所以必須調(diào)結(jié)細(xì)胞所在的環(huán)境溶液濃度，以保證原生質(zhì)體的穩(wěn)定。不同的微生物細(xì)胞對(duì)溶液濃度與種類的要求不同。菌體的不同生理狀態(tài)，直接影響到細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、菌體的代謝水平及菌體的活力等。菌齡過短的菌絲經(jīng)酶解破壁形成小原生質(zhì)體，有的細(xì)胞器不完全，營(yíng)養(yǎng)供給不足，再生能力也較低。菌齡長(zhǎng)的原生質(zhì)體再生率高，且再生時(shí)間遠(yuǎn)比菌齡短的原生質(zhì)體再生時(shí)間短。酶中往往含有對(duì)原生質(zhì)

24、體有害的酶類，隨著酶量的增加，雜酶的濃度也會(huì)隨之增加，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，必然會(huì)影響原生質(zhì)體的活性;而且酶濃度過大，細(xì)胞脫壁太徹底，必然降低原生質(zhì)體的再生率。酶解液pH值不僅影響酶的活力和底物的特性，改變?nèi)鼙谛Ч?，而且影響己脫壁原生質(zhì)體的穩(wěn)定。酶解過程中輕微振蕩有利于原生質(zhì)體的釋放，能與酶充分接觸菌絲體或與氧的供應(yīng)有關(guān)。此外，有一些影響因素如:菌體濃度、分散程度和遺傳性等。原生質(zhì)體制備時(shí)的酶濃度和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響較大。酶濃度的高低也影響原生質(zhì)體的再生，因?yàn)樵谶^高濃度的酶制備原生質(zhì)體時(shí)細(xì)胞受損傷較大，失去了重新建成原來細(xì)胞所必要的因子，影響原生質(zhì)體的再生。酶解時(shí)間與原生質(zhì)體形成率成正比，與再生率成反比。原因是酶解時(shí)間越短，細(xì)胞壁脫壁越不完全，較易再生出細(xì)胞壁，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，脫壁越完全，原生質(zhì)膜易被酶液破壞，再生較困難。原生質(zhì)體的再生率還受菌株木身的性質(zhì)、菌體預(yù)處理方式等多種因素影響。在原生質(zhì)體制備和再生的過程中，應(yīng)該綜合考慮原生質(zhì)體制備和再生的影響因素，達(dá)到較高的原生質(zhì)體再生率和最佳的原生質(zhì)體制備條件的統(tǒng)一。5 結(jié)論1、 本試驗(yàn)結(jié)合三種馴化方法，從長(zhǎng)年生產(chǎn)咪唑乙煙酸的農(nóng)藥廠排污口的污泥及廢水中分離得到1株能以咪唑乙煙酸