流式細胞儀的工作原理和基本結構

1、職業(yè)教育醫(yī)學檢驗技術專業(yè)教學資源庫流式細胞儀的基本結構和工作原理滄州醫(yī)學高等?？茖W校滄州醫(yī)學高等?？茖W校 劉玉枝劉玉枝流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構 1. 1.流式細胞儀流式細胞儀分析對象：生物顆粒，包括大的免分析對象：生物顆粒，包括大的免疫復合物、疫復合物、DNADNA、RNARNA、蛋白質、病毒顆粒、脂質體、蛋白質、病毒顆粒、脂質體、細胞器、細菌、霉菌、染色體、真核細胞、雜交細胞細胞器、細菌、霉菌、染色體、真核細胞、雜交細胞、聚集細胞等。、聚集細胞等。 2.2.檢測生物顆粒的理化性質：包括細胞大小、細檢測生物顆粒的理化性質：包括細胞大小、細胞形態(tài)、胞漿顆?；?/p>

2、度、胞形態(tài)、胞漿顆?；潭?、DNADNA含量、總蛋白質含量、含量、總蛋白質含量、細胞膜完整性和酶活性等。細胞膜完整性和酶活性等。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構 1.1.生物學顆粒分析原理生物學顆粒分析原理 2.2.細胞分選原理細胞分選原理一、流式細胞儀的工作原理一、流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構1 1生物顆粒分析的原理生物顆粒分析的原理 （1 1）懸浮分散的單細胞懸液經懸浮分散的單細胞懸液經熒光染料染色后，放人樣品管。熒光染料染色后，放人樣品管。在液流泵作用下，垂直進入流在液流泵作用下，垂直進入流動室，沿流動室的軸

3、心向下流動室，沿流動室的軸心向下流動。流動室軸心至外壁的鞘液動。流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞細胞懸也向下流動，形成包繞細胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流從液的鞘液流，鞘液和樣品流從噴嘴孔噴出，在測量區(qū)與水平噴嘴孔噴出，在測量區(qū)與水平方向的激光束垂直相交。方向的激光束垂直相交。 流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構1 1生物顆粒分析的原理：生物顆粒分析的原理： （2 2）染色的細胞在測量區(qū)受激染色的細胞在測量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時產生光照射后發(fā)出熒光，同時產生光散射。這些信號分別被光電光散射。這些信號分別被光電倍增管和光電二極管接收，經倍增管和光電二極管接

4、收，經過計算機儲存、計算、分析這過計算機儲存、計算、分析這些數字化信息，就可得細胞的些數字化信息，就可得細胞的大小和核酸含量等指標。大小和核酸含量等指標。 2 2細胞分選的原理細胞分選的原理 在壓電晶體加上信號，產生同頻率的機械振動，流動室隨在壓電晶體加上信號，產生同頻率的機械振動，流動室隨之振動，促使通過測量區(qū)的液柱斷裂成一連串均勻的液滴。之振動，促使通過測量區(qū)的液柱斷裂成一連串均勻的液滴。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構 2 2細胞分選的原理細胞分選的原理 細胞分選：細胞分選：當某類細胞的當某類細胞的特性與要分選的細胞相同時，特性與要分選的細胞相同時，流式細胞儀

5、就會在這類細胞形流式細胞儀就會在這類細胞形成液滴時給含有這類細胞的液成液滴時給含有這類細胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉板間的靜的液滴向下落入偏轉板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉或向右偏轉，落入別向左偏轉或向右偏轉，落入指定的收集器內，達到細胞分指定的收集器內，達到細胞分類收集目的。類收集目的。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構 二、二、流式細胞儀的基本結構流式細胞儀的基本結構流式細胞儀由下列基本結構組成：流式細胞儀由下列基本結構組成： 1.1.流動室與液流驅動系統(tǒng)流動室與液流驅動系統(tǒng)

6、4.4.信號檢測與分析信號檢測與分析 5.5.細胞分選器細胞分選器 2.2.激光光源與光束成形系統(tǒng)激光光源與光束成形系統(tǒng) 3.3.光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構1 1流動室與液流驅動系統(tǒng)流動室與液流驅動系統(tǒng)（1 1）流動室：由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔，）流動室：由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，流動室內充滿了鞘供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，流動室內充滿了鞘液液, ,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構1 1流動

7、室與液流驅動系統(tǒng)流動室與液流驅動系統(tǒng) 樣品流在鞘流的環(huán)包下形成聚焦，保證每個細胞通過激樣品流在鞘流的環(huán)包下形成聚焦，保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構11 空氣泵產生壓縮空氣，通過鞘流壓力調節(jié)器加在鞘液空氣泵產生壓縮空氣，通過鞘流壓力調節(jié)器加在鞘液上恒定的壓力，鞘液以勻速運動流過流動室，在整個上恒定的壓力，鞘液以勻速運動流過流動室，在整個系統(tǒng)運行中流速不變。系統(tǒng)運行中流速不變。 1 1流動室與液流驅動系統(tǒng)流動室與液流驅動系統(tǒng)流式細胞儀的工作原理和基本結構流

8、式細胞儀的工作原理和基本結構2 2激光光源與光束形成系統(tǒng)激光光源與光束形成系統(tǒng) 激光：是一種相干光源，它能提供單波長、高強度及激光：是一種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。 流式細胞儀多采用氬離子氣體激光器。流式細胞儀多采用氬離子氣體激光器。 激光光束經透鏡聚焦，形成短軸稍大于細胞直徑的光斑，激光光束經透鏡聚焦，形成短軸稍大于細胞直徑的光斑，再進入流動室。再進入流動室。 流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構2 2激光光源與光束形成系統(tǒng)激光光源與光束形成系統(tǒng) 細胞快速流動，

9、每個細胞經過光照區(qū)的時間僅約為細胞快速流動，每個細胞經過光照區(qū)的時間僅約為1s1s，細胞攜帶熒光物質所激發(fā)出的熒光信號強弱與被照射的時間細胞攜帶熒光物質所激發(fā)出的熒光信號強弱與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關，因此細胞必須達到足夠的光照強度。和激發(fā)光的強度有關，因此細胞必須達到足夠的光照強度。 流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構3 3光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)組成：透鏡、濾光片和小孔。組成：透鏡、濾光片和小孔。作用：將不同波長的光信號進行分離、聚集后，送入不同的作用：將不同波長的光信號進行分離、聚集后，送入不同的光電轉換和電子探測器。光電轉換和電子探測器。流式細胞儀的工作原理和基

10、本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構3 3光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)濾光片分類：濾光片分類：（1 1）長通濾光片：使特定波長以上的光通過，長通濾光片：使特定波長以上的光通過，LPLP表示。表示。（2 2）短通濾光片：特定波長以下的光通過，短通濾光片：特定波長以下的光通過，SPSP表示。表示。（3 3）帶通濾光片：允許一定波長范圍內的光通過，帶通濾光片：允許一定波長范圍內的光通過，BPBP表示。表示。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構4 4信號檢測與分析系統(tǒng)信號檢測與分析系統(tǒng)系統(tǒng)構成：光電二極管和計算機。系統(tǒng)構成：光電二極管和計算機。細胞產生的激光散射信號和熒光信號照射到光電二極

11、管散射細胞產生的激光散射信號和熒光信號照射到光電二極管散射光檢測器上，經轉換器轉換為電子信號后，輸入到放大器進光檢測器上，經轉換器轉換為電子信號后，輸入到放大器進行線性放大或對數放大，計算機分析這些數字化信息，得到行線性放大或對數放大，計算機分析這些數字化信息，得到相應結果。相應結果。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構4 4信號檢測與分析系統(tǒng)信號檢測與分析系統(tǒng)（1 1）激）激光信號：光信號： 前向角散射：被測細胞的大小有關。前向角散射：被測細胞的大小有關。 側向角散射：提供細胞內精細結構和顆粒性質的信息。側向角散射：提供細胞內精細結構和顆粒性質的信息。流式細胞儀的工作

12、原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構4 4信號檢測與分析系統(tǒng)信號檢測與分析系統(tǒng)（2 2）熒光信號）熒光信號 當激光光束與細胞正交時，特異熒光素標記當激光光束與細胞正交時，特異熒光素標記細胞受激發(fā)發(fā)射熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定細胞受激發(fā)發(fā)射熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析能了解所研究細胞的性質和數量。量分析能了解所研究細胞的性質和數量。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構4 4信號檢測與分析系統(tǒng)信號檢測與分析系統(tǒng)（2 2）熒光信號）熒光信號 當激光光束與細胞正交時，特異熒光素標記當激光光束與細胞正交時，特異熒光素標記細胞受激發(fā)發(fā)射熒光信號，

13、通過對這類熒光信號的檢測和定細胞受激發(fā)發(fā)射熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析能了解所研究細胞的性質和數量。量分析能了解所研究細胞的性質和數量。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構4 4信號檢測與分析系統(tǒng)信號檢測與分析系統(tǒng) 熒光信號線性測量和對數測量：線性放大器的輸出與輸入是熒光信號線性測量和對數測量：線性放大器的輸出與輸入是線性關系。線性關系。 線性測量用于線性測量用于細胞細胞DNADNA含量、含量、RNARNA含量、總蛋白質含量測定。含量、總蛋白質含量測定。 對數測量：用于對數測量：用于在細胞膜表面抗原等熒光檢測。在細胞膜表面抗原等熒光檢測。 熒光信號的面積

14、和寬度：熒光信號的面積和寬度： 熒光信號的面積：采用對熒光光通量進行積分測量，多用于熒光信號的面積：采用對熒光光通量進行積分測量，多用于DNADNA倍體測量。倍體測量。 熒光信號的寬度：常用來區(qū)分雙連體細胞。熒光信號的寬度：常用來區(qū)分雙連體細胞。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構5 5細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng) 系統(tǒng)組成：水滴形成、分選邏輯電路、水滴充電及偏轉。系統(tǒng)組成：水滴形成、分選邏輯電路、水滴充電及偏轉。 （1 1）小水滴的形成：壓電晶體振動使噴出的流束形成水滴，小水滴的形成：壓電晶體振動使噴出的流束形成水滴，并帶動流動室振動。并帶動流動室振動。 噴嘴的振動頻率即

15、每秒鐘產生水滴的數目。噴嘴的振動頻率即每秒鐘產生水滴的數目。 流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構5 5細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng) 當噴嘴直徑為當噴嘴直徑為50m50m時，信號頻時，信號頻率為率為40kHz40kHz，則每秒鐘產生，則每秒鐘產生4 4萬個水萬個水滴。若每秒鐘流出的細胞是滴。若每秒鐘流出的細胞是10001000個，個，則平均每則平均每4040個水滴中只有一個水滴個水滴中只有一個水滴是有細胞的，其他皆為空白。是有細胞的，其他皆為空白。 流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構5 5細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng) （2 2）分選）分選邏輯電路邏輯電

16、路 細胞在經過測量區(qū)時判斷出哪個細胞在經過測量區(qū)時判斷出哪個細胞滿足了分選的條件，并產生一細胞滿足了分選的條件，并產生一個邏輯信號，此信號驅動充電脈沖個邏輯信號，此信號驅動充電脈沖發(fā)生器，使之產生充電脈沖。發(fā)生器，使之產生充電脈沖。流式細胞儀的工作原理和基本結構流式細胞儀的工作原理和基本結構5 5細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng) （3 3）水滴的充電與偏轉水滴的充電與偏轉 當水滴從流束上要斷開當水滴從流束上要斷開時給整個流束充電，便帶有時給整個流束充電，便帶有同極性的多余表面電荷。下同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時，帶正電極形成的靜電場時，帶正電荷的水滴向帶負電的電極板荷的水滴向帶負電的電極板偏轉，可用容器收集水滴。偏轉，可用容器