土壤微生物量碳測定方法

1、土壤微生物量碳測定方法及應(yīng)用土壤微生物量碳(Soilmicrobialbiomass)不僅對土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分的循環(huán)起著主要作用，同時是一個重要活性養(yǎng)分庫，直接調(diào)控著土壤養(yǎng)分(如氮、磷和硫等)的保持和釋放及其植物有效性。近40年來，土壤微生物生物量的研究已成為土壤學(xué)研究熱點之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbialbiomasscarbon,Bc)來表示土壤微生物生物量的大小。測定土壤微生物碳的主要方法為熏蒸培養(yǎng)法(Fumigation-incubation,FI)和熏蒸提取法(Fumigation-extraction,FE)。熏蒸提取法(FE法)由于熏

2、蒸培養(yǎng)法測定土壤微生物量碳不僅需要較長的時間而且不適合于強酸性土壤、加入新鮮有機底物的土壤以及水田土壤。Voroney(1983)發(fā)現(xiàn)熏蒸土壤用0.5molL-1&SO提取液提取的碳量與生物微生物量有很好的相關(guān)性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法測定土壤微生物碳的基本方法：該方法用0.5molL-1&SO提取劑(水土比1:4)直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有機碳含量用重鉻酸鉀氧化法測定；以熏蒸與不熏蒸土壤提取的有機碳增加量除以轉(zhuǎn)換系數(shù)Ke(取值0.38)來計算土壤微生物碳。Wuj(1990)通過采用熏蒸培養(yǎng)法和熏蒸提取法比較研究，建立了熏蒸提取一一碳自動一起法測定土

3、壤微生物碳。該方法大幅度提高提取液中有機碳的測定速度和測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。林啟美等(1999)對熏蒸提取-重鉻酸鉀氧化法中提取液的水土比以及氧化劑進(jìn)行了改進(jìn)，以提高該方法的測定結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。對于熏蒸提取法測定土壤微生物生物碳的轉(zhuǎn)換系數(shù)&C的取值，有很多研究進(jìn)行了大量的研究。測定G值的實驗方法有：直接法(加入培養(yǎng)微生物、用14C底物標(biāo)記土壤微生物)和間接法(與熏蒸培養(yǎng)法、顯微鏡觀測法、ATP法及底物誘導(dǎo)呼吸法比較)。提取液中有機碳的測定方法不同(如氧化法和儀器法)，那么轉(zhuǎn)換系數(shù)&c取值也不同，如采用氧化法和一起法G值分別為0.38(Vance等，1987)和0.45(Wu等

4、，1990)。不同類型土壤(表層)的山值有較大不同，其值變化為0.20-0.50(Sparling等，1988,1990;Bremer等，1990)。Dictor等(1998)研究表明同一土壤剖面中不同濃度土層土壤的轉(zhuǎn)換系數(shù)G有較大的差異，從表層0-20cm土壤的Kec為0.41,逐步降低到180-220cm土壤的&c為0.31。一、基本原理熏蒸提取法測定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤時由于微生物的細(xì)胞膜被氯仿破壞而殺死，微生物中部分組分成分特別是細(xì)胞質(zhì)在酶的作用下自溶和轉(zhuǎn)化為K2SO4溶液可提取成分(Joergensen,1996)。采用重鉻酸鉀氧化法或碳-自動分析儀器法測定提取

5、液中的碳含量，以熏蒸與不熏蒸土壤中提取碳增量除以轉(zhuǎn)換系數(shù)Kec來估計土壤微生物碳。二、試劑配制(1)硫酸鉀提取劑(0.5molL-1):取871.25g分析純硫酸鉀溶解于蒸儲水中，定溶至10L。由于硫酸鉀較難溶解，配制時可用20L塑料桶密閉后置于苗床上(60-100revmin-1)12小時即可完全溶解。(2) 0.2molL-1(1/6K2Cr2Q)標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取130c烘2-3小時的RCnQ(分析純)9.806g于1L大燒杯中，加去離子水使其溶解，定溶至1L。K2C2。較難溶解，可加熱加快其溶解。(3) 0.1000molL-1(1/6K2Cr2。)標(biāo)準(zhǔn)溶液：取經(jīng)130c烘2-3小時的分析

6、純重銘酸鉀4.903g,用蒸餾水溶解并定溶至1L。（4）鄰啡羅咻指示劑：取鄰啡羅咻指1.490g溶于含有0.700g分析純硫酸亞鐵（FeSO7HO）的100ml蒸餾水中，此溶液易變質(zhì)，應(yīng)密閉保存于棕色瓶中。（5）硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05molL-1）:稱取13.9g分析純硫酸亞鐵（FeSO7HO）,溶于800ml蒸儲水中，慢慢加濃硫酸5ml（防止水解），定溶至1L,保存于棕色瓶中。此溶液易被空氣氧化，每次使用時必須標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度：硫酸亞鐵溶液標(biāo)定方法：吸取0.1000molt（I/6K2C2。）標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0ml（濃度為0.05molL-1,1/6（最。），放入150ml的三角瓶中，加濃硫酸

7、5ml和鄰啡羅咻指示劑2滴，用硫酸亞鐵溶液滴定，滴至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)樽丶t色即為終點。根據(jù)滴到終點消耗的硫酸亞鐵溶液量計算其準(zhǔn)確濃度，即C2=（C1*V1）/V2。式中：C1重銘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（0.1000molL-1）C2硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（molL-1）V1吸取的重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（5ml）V2滴到終點時消耗硫酸亞鐵溶液體積（ml）（6）去乙醇氯仿制備：在通風(fēng)櫥中，將分析純氯仿與蒸儲水按1:2（V:V）加入分液漏斗中，充分搖動1分鐘，慢慢放出底層氯仿于燒杯中。如此洗3次。得到的純氯仿用無水氯化鈣出去氯仿中的水分，于試劑瓶中在低溫（4）黑暗狀態(tài)可保存幾周（Williamss等，1995）

8、三、儀器設(shè)備：Phoenix8000碳-自動分析儀，50ml可調(diào)移液器，往復(fù)式振蕩器（300rev-min-1）,50ml燒杯，50ml聚乙烯瓶，125ml聚乙烯瓶，150ml消化管（24*295mm），250ml三角瓶，50ml酸式滴定管。土壤篩（孔徑2mrm,22cm真空干燥器，水泵抽真空裝置，pH-自動滴定儀。四、操作方法：（ 1） 土樣前處理：新鮮土壤應(yīng)立即處理或保存于4冰箱中，測定前仔細(xì)除去土樣中可見植物殘體（如根、莖和葉）及土壤動物（蚯蚓等），過篩（孔徑2mm），徹底混勻。處理過程應(yīng)盡量避免破壞土壤結(jié)構(gòu)，土壤含水量過高應(yīng)在室內(nèi)適當(dāng)風(fēng)干，以手感濕潤疏松但不結(jié)塊為宜（約為飽和持水量的4

9、0%）。土壤濕度不夠可以用蒸餾水調(diào)節(jié)至飽和持水量的40%。次樣品即可用于土壤實時測定。開展其他研究（如培養(yǎng)試驗）可將土壤置于密閉的大塑料桶內(nèi)培養(yǎng)7-15天，桶內(nèi)應(yīng)有適量水以保持濕度，內(nèi)放一小杯1molL-1NaOH容液吸收土壤呼吸產(chǎn)生的CO,培養(yǎng)溫度為25.經(jīng)過前培養(yǎng)的土壤應(yīng)立即分析。如果需要保留，應(yīng)放置于4的冷藏箱中，下次使用前需要在上述條件下至少培養(yǎng)24小時。這些過程為消除土壤水分限制對微生物的影響，及植物殘體組織對測定的干擾。土壤飽和持水量測定可按Shaw（1958）的方法：在圓形漏斗莖上裝一帶夾子的橡皮管，漏斗內(nèi)塞上玻璃纖維塞，取50g土壤于漏斗中，夾緊橡皮塞，加入50ml水保持30分

10、鐘，然后打開夾子并測定30分鐘內(nèi)滴下的水的體積，加入的水量減以滴下的水量再加原來土壤中含的水量即為該土壤的飽和含水量。（ 2） 土壤熏蒸稱取經(jīng)前處理的新鮮土壤（含水量為飽和持水量的40%3份25.0g（烘干基重）土樣于50ml燒杯中，用去乙醇氯仿熏蒸，方法是將其置于底部有少量水（約200ml）和去乙醇氯仿（40ml）的真空干燥器中，氯仿加入燒杯中，并在其中放入經(jīng)濃硫酸處理的碎瓷片（0.5cm大小，防爆）。在-0.07MPa真空度下使氯仿劇烈沸騰3-5分鐘后，關(guān)閉真空干燥器閥門，移置在25黑暗條件下熏蒸土壤24小時；然后將土壤轉(zhuǎn)入另一干凈真空干燥器中，反復(fù)抽真空（-0.07MPa）6次，每次3分

11、鐘，徹底出去土壤中氯仿（殘留在土壤中的氯仿對提取碳的測定有較大的影響）。在熏蒸同時，另取3份25.O（烘干基重）土壤于125ml提取瓶中（為不熏蒸對照）。由于熏蒸過程需要24小時，因此通常在熏蒸時，將不熏蒸土壤可置于4條件下保存。（ 3） 土壤提取將除去氯仿后的熏蒸土壤轉(zhuǎn)移到125ml提取瓶中，與不熏蒸土壤同時采用50ml可調(diào)加液器加入100ml0.5molL-1&SO提取液，水土比為1:4,并設(shè)3個試劑空白。如果采用重銘酸鉀氧化法測定提取液中有機碳，也可采用2:;1的水土比，即加入50ml0.5molL-1&SO提取液。在往復(fù)式振蕩器中振蕩（300revmin-1）提取30分

12、鐘，再用定量中速濾紙過濾于50ml塑料瓶中，貯藏于-18冷凍柜中，待測。經(jīng)貯藏的土壤提取液解凍后會有一些白色沉淀，據(jù)推測為CaSO4和4K2SO4，對提取液中有機碳的測定沒有影響，可以不必除去這些白色沉淀（Brookes等，1985）。（ 4） 提取液中有機碳含量測定和土壤微生物碳計算：方法I:重銘酸鉀氧化法（林啟美等1999;Vance等1987）吸取10ml上述土壤提取液于經(jīng)過仔細(xì)檢查的150ml消化管（24*295mrm中，加入5.0ml0.2mol-L-1K2C2Q,5.0ml濃H2SO溶液，再加入少量經(jīng)濃硫酸處理的碎瓷片（3mm小，防爆），混勻，置于175±1磷酸浴中煮沸1

13、0分鐘，應(yīng)注意消煮的時間應(yīng)保證準(zhǔn)確一致。冷卻后將溶液轉(zhuǎn)移到150ml三角瓶中，使總體積約為80ml,加入1滴鄰啡羅咻指示劑，用0.05mol-L-1硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定消煮液中剩余的重鉻酸鉀，滴定過程為先由橙黃色變?yōu)樗{(lán)綠色，再變?yōu)樽丶t色，即到達(dá)終點。結(jié)果計算：提取的土壤有機碳（mgCkg-1土）=0.012/4*106*M*（V0-V）*f/W式中：M-為FeSO溶液濃度（molL-1）;V0、V分別為滴定空白和樣品消耗的FeSO溶液體積（ml）;f為稀釋倍數(shù)；W為烘干土重（g）；0.012為碳毫摩爾質(zhì)量（g）；106為換算系數(shù)。土壤微生物碳：Bc=Ec/Kc式中：Bc代表土壤微生物碳（mgC

14、kg）；Ec=熏蒸土壤提取的有機碳-不熏蒸土壤提取的有機碳，單位mgCkg-1；Kc為轉(zhuǎn)換系數(shù)，采用重銘酸鉀氧化法取值0.38（Vance等，1987）。方法H:碳-自動分析儀器法（Wi<,1990）取10ml土壤提取液于40ml樣品瓶中。加入10ml，5%六偏磷酸鈉溶液（pH2.0），使提取液中的沉淀（CaSO?口4K2SO）全部溶解。再用直徑為2mmi勺細(xì)管向樣液中通過高純度氮氣（5-10分鐘），以除去溶解在樣液中的CO,然后用Phoenix8000碳-自動分析儀測定，待測提取液中的有機碳在硫酸鉀溶液作用下于紫外氧化室中氧化為CO2，該儀器可自動測定有機碳氧化放出的CO量，通過工作曲線即可計算出提取液中的碳含量。工作曲線制備：分別吸取0、0.5、1、2、3、4ml濃度為1000mgC-L1鄰苯二甲酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液溶于50ml容量瓶中，用高純度去離子水定容，即為0、10、20、40、60、80mgC-L1系