HXY生物制藥學實驗范文

1、實驗一 堿裂解法小量制備質粒DNA（4學時）一、實驗目的1. 了解質粒的特性及其在分子生物學研究中的廣泛應用2. 學習和掌握堿裂解法提取質粒的原理和操作方法二、實驗原理質粒（plasmid）是細菌細胞內的一種共價閉合環(huán)狀DNA（簡稱cccDNA）分子，作為一個具有自身復制起點的復制單位獨立于細胞的染色體之外，質粒DNA上攜帶了部分的基因信息，經(jīng)過基因表達后使其宿主細胞表現(xiàn)相應的性狀，能傳給子代并在子代細胞中保持一定的拷貝數(shù)，也可丟失及在細菌之間轉移?，F(xiàn)在常用的質粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術中重要的載體，可通過連接外源基因構成重組體。從宿主菌中提取質粒DN

2、A是DNA重組技術中最基礎的實驗技能。質粒抽提的方法很多，但原理和操作步驟都大同小異，以堿裂解法最為常用。堿裂解法提取質粒是根據(jù)質粒的cccDNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。使用SDS和強堿處理裂解細菌細胞后，在pH值介于12.012.5這個范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，然而cccDNA的氫鍵雖會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互纏繞，仍會緊密地結合在一起。當加入乙酸鉀溶液將pH值恢復至中性時，共價閉合環(huán)狀的質粒DNA的兩條互補鏈迅速而準確地復性，DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，

3、復性不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結構，和不穩(wěn)定的大分子RNA，變性的蛋白質SDS復合物等一起沉淀下來，從而可以通過離心去除。三、試劑和器材試劑1. LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，調pH至7.0，高壓滅菌。2. LB+Amp培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基內加入50g/mL的氨芐青霉素。注意Amp遇高溫分解，待培養(yǎng)基溫度低于60時加入。3. 溶液（50 mM 葡萄糖,25 mM Tris-HCl, 10mM EDTA,pH8.0）稱取0.3g Tris，0.37g EDTA二鈉鹽，用適量雙蒸水溶解后用HCl調pH至8.0，定容到100mL，再加入0.99

4、g葡萄糖。4. 溶液 （0.2 M NaOH, 1% SDS）稱取0.8g NaOH和1g SDS溶于雙蒸水，定容至100mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。5. 溶液 (K+=3M, Ac=5M)取5 mM KAc溶液60mL，冰醋酸 11.5mL， H2O 28.5mL混勻。6. TE緩沖液（10mM pH8.0 Tris-HCl，1mM EDTA）稱取0.12g Tris，0.037g EDTA二鈉鹽,加適量雙蒸水溶解，用HCl調至pH8.0并定容至100mL，高壓濕熱滅菌，4保存?zhèn)溆谩?. 無水乙醇和70%乙醇8. 酚:氯仿:異戊醇（體積比25:24:1）9. RNase A（10mg/mL）稱取不含DN

5、A酶的RNase A 0.1g，溶于10mL TE中，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20。材料攜帶質粒（pET32a質粒）的大腸桿菌器材滅菌鍋、恒溫搖床、離心機、微量移液器、制冰機、三角瓶、Eppendorf管、試管、培養(yǎng)皿、試劑瓶、超凈工作臺。四、實驗步驟(一) 細菌的培養(yǎng)將含有質粒的大腸桿菌接種于LB+Amp液體培養(yǎng)基中，250 r/min，37搖床培養(yǎng)過夜。(二) 質粒提取1. 取1.5 mL培養(yǎng)液加入Eppendorf管中，5000 r/min 離心3 min。棄去上清，保留菌體沉淀。如菌量不足可再加入培養(yǎng)液，重復離心，手機菌體。2. 將菌體沉淀懸浮于100L溶液中，蓋緊管口，充分

6、振蕩混勻，室溫放置5-10 min。 3. 加入200 L新鮮配制溶液 ，蓋緊管口，顛倒數(shù)次輕柔混勻 (勿劇烈震蕩)，此時菌液應該變得清亮，將離心管放冰上5 min 。4. 加入150 L冰上預冷的溶液 ，蓋緊管口，溫和顛倒數(shù)次使混勻，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀。冰上放置5-10 min 。5. 4，12000 r/min離心10 min ，將上清轉至另一Eppendorf管中。6. 向上清中加入等體積酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），反復混勻，12000 r/min離心10 min，將上清轉移到另一Eppendorf管中。7. 向上清加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻后，室溫放置15-20mi

7、n。12000 r/min離心10 min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干管壁粘附的液體。8. 加入1mL 70%乙醇洗滌沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥，即得到質粒DNA制品。9. 將DNA溶于30 L TE（含有20 g/mL的RNase A）中，-20保存，備用。五、注意事項1.細菌培養(yǎng)過程中要求無菌操作。槍頭、離心管等都需要滅菌。2.制備質粒的過程中，注意操作緩和，以避免機械剪切力對DNA的損傷。3.加入溶液III后，可用小玻璃棒輕輕攪開團狀沉淀物，防止質粒DNA被包埋在沉淀物內。4.為充分除去殘余的蛋白質，可用酚/氯仿/異戊醇混合液進行多次抽提，直至兩相間

8、物蛋白沉淀。思考題1. 堿裂解法提取質粒的過程中，溶液I、II、III的作用是什么？2. 質粒提取過程中應注意哪些操作？實驗二 限制性內切酶切割DNA（4學時）一、實驗目的1.掌握DNA的酶切技術2.通過對質粒DNA的酶切，學會根據(jù)目的基因合理選擇載體與限制性內切酶，設計構建重組DNA分子二、實驗原理限制性內切酶是從細菌中分離出來的一中能在特異位點切割DNA分子的核酸內切酶，已有400余種，每種酶有其特定的核苷酸序列識別特異性，酶的活性需Mg2+來激活。不同的酶也有許多差別：有些酶除需Mg2+外，還需ATP 等其他輔助因子的激活；切割位點和識別序列間的距離不同；有的內切酶同時具有甲基化作用。根

9、據(jù)這些差別，可將限制性內切酶分為I、II和III類型。II 型限制性內切酶只需要Mg2+的激活，酶在其識別序列內切割雙鏈DNA，產(chǎn)生的各種DNA片段具有相同的末端結構，而且大多數(shù)的II 型酶可提供粘性未端，有利于片段再連接，大部分II 型酶所識別的序列具有反向對稱的結構，或稱之回文結構。例如EcoRI 和HindIII 的識別和切口分別為：限制性內切酶對環(huán)狀質粒DNA產(chǎn)生的酶切片段數(shù)與切口數(shù)一致。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切口的數(shù)目；從片段遷移率可判斷酶切片段大小。用已知分子量的線狀DNA為對照，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對分子大

10、小。質粒在細胞內有三種構型：共價閉環(huán)DNA，常以超螺旋形式存在；如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開環(huán)DNA；雙鏈線狀DNA由于兩條鏈的切口在同一部位被切斷，不能成環(huán)，完全開放成線狀，簡稱線性DNA。三種構型的質粒DNA 在電泳時的泳動速度為：共價閉環(huán)DNA線狀DNA 開環(huán)DNA。限制性內切酶作用的溫度一般是37，反應體系中以Mg2+為唯一的輔助因子，且要求pH值在7.5左右。商品酶都保存在50%甘油溶液中，-20保存，活性一般為2-10U/L.(37溫度下反應1小時，將1 g的DNA完全分解的酶量定義為1個活性單位U)pET32a質粒圖譜

11、：三、試劑和器材材料：待酶切的質粒DNA樣品（pET32a質粒）試劑：Bgl I 限制性內切酶10buffer：50 mM NaCl10 mM Tris-HCl(pH7.5)10mM MgCl21mM DTT(二硫蘇糖醇)器材：Eppendorf管，Tip，冰盒，微量移液器，恒溫水浴箱，電泳儀，電泳槽、紫外檢測燈四、實驗步驟1在滅菌的Eppendorf管中依次分別加入以下試劑：（注意：限制酶很昂貴，從-20取出后要置于冰盒中，吸取要使用新的Tip頭，以免污染雜質，用完后盡快放回冰箱）10buffer 2L質粒DNA 2LddH2O 15LBgl I酶 1L2將反應液混勻，稍離心使管壁上的液體聚

12、集到底部，置于37水浴中保溫1h。3加入1L 0.5M EDTA（pH8.0）或. 65保溫5-10min以終止反應。4進行1.2% 瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30-45min。5在紫外燈下檢測酶切效果。五、注意事項1. 基因操作學實驗多為微量操作，DNA樣品與限制酶的用量都極少，必須嚴格注意吸量的準確性。吸樣時，將Tip頭的尖部剛剛接觸到液面時，輕輕吸取，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣會使Tip外壁上粘附很多樣品，導致用量不準。2. 限制酶價格昂貴，因此注意不要使其污染二導致浪費。另外限制酶的保存不當也極易導致失活，因此注意在加樣的最后一步才加限制酶，并且在冰上操作，且取用完后盡

13、快放回冰箱。3. 開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內面，以防污染。4. 在水浴中溫育時，要將Eppendorf管蓋蓋緊，以防水進入管內造成實驗失敗。思考題影響核酸內切限制酶活性的因素有哪些？實驗三 聚合酶鏈式反應（PCR）（4學時）一、實驗目的學習并掌握PCR實驗技術的原理以及操作步驟二、實驗原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):模板的雙鏈DNA在94下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫

14、鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板，在引物3端繼續(xù)延伸合成DNA。由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA 又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35 輪循環(huán)就可使DNA擴增達106倍。PCR的特異性是由兩個人工合成的引物序列決定的。待擴增DNA模版加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA的同源性序列識別并復性。本實驗以實驗一中制備的質粒DNA樣品作為模板，利用一對引物，通過PCR反應可特異性擴增出其中一段DNA片段。三、試劑和器材材料：質粒DNA樣品，引物（1對）試劑：d

15、NTP，Taq DNA聚合酶，10PCR buffer，MgCl2，PCR專用無菌水器材：PCR儀，制冰機，微量移液器，Tip，PCR管四、實驗步驟1. 按以下順序配制PCR反應體系（50L總體積）：【注意：陰性對照不加模板，用ddH2O代替】10PCR buffer(不含Mg2 +)5L25mmol /L MgCl23L四種dNTP4L引物11L引物21LDNA模板5LddH2O30.5LTaq DNA聚合酶0.5L2. 蓋緊管蓋，將PCR管置入PCR儀中，按照以下程序運行：94預變性4min后開始以下循環(huán)94變性30s，49退火30s，72延伸40s，共35個循環(huán)，最后在72延伸10min

16、，4 停止反應3. 取出5-10L PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。五、注意事項1. 在配制PCR反應體系時，要細心，注意不要多加和漏加。2. Taq DNA聚合酶存于-20冰箱，取用時應置于冰浴中，用完后及時放回冰箱。思考題1. 影響PCR反應的條件有哪些？2. 如果讓你來設計一段已知DNA序列的上下游引物，應該注意哪些方面？實驗四 DNA的瓊脂糖凝膠電泳（4學時）一、實驗目的學習并掌握DNA凝膠電泳的技術原理和操作方法，掌握識讀電泳圖譜的方法。二、實驗原理瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。瓊脂糖主要在DNA電泳中作為一種固體支持基質，可以制成各種形狀

17、、大小和孔隙度，其密度取決于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從100bp至近50kb的DNA片段。該技術操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。在電場中，在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移。長度不同的DNA分子由于受凝膠阻遏作用大小不一，遷移速度不同，從而達到有效分離DNA的目的。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA 條帶,用

18、于以后的克隆操作。三、試劑和器材材料：PCR產(chǎn)物或限制性酶切產(chǎn)物，瓊脂糖試劑：1kb DNA分子量Marker，10上樣緩沖液 10mg/mL的溴化乙錠(EB):帶手套小心稱取1g EB，轉移到廣口瓶中，加100mL雙蒸水，用磁力攪拌器攪拌直到完全溶解。用鋁箔包裹裝液管，于4貯存。50Tris-乙酸（TAE）緩沖液（用時稀釋成1的工作濃度）：稱量Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g 于1L燒杯中，加入約800mL雙蒸水充分攪拌均勻，加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解，最后加水定容至1L后，室溫保存。器材：電泳裝置：電泳儀、水平電泳槽、梳子、制膠槽紫外透射儀或凝膠成像儀微波爐，微量移液器，Tip，200mL錐形瓶四、實驗步驟1. 取 50TAE 緩沖液20ml 加水至1000ml,配制成1TAE緩沖液，待用。2. 1.2%膠液的制備：稱取0.6g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中,加入50mL TAE緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊