DIG應(yīng)用小帖士

1、DIG應(yīng)用小帖士： DNA的標(biāo)記和檢測（Southern Blotting）如果用以探針合成的DNA的模板的數(shù)量比較少或者質(zhì)量不夠高的時候，建議您使用PCR DIGProbe Synthesis Kit。該試劑盒是專用于制備高靈敏度的雜交探針，例如單拷貝的基因。其另一個特點就是無需之間的定量斑點檢測過程，通過定量凝膠電泳就可以快速確定PCR標(biāo)記探針的效率。    如果您手上有足夠數(shù)量的高純度模板，就建議您使用采用隨機引物標(biāo)記方法的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kits I 和II。這兩

2、個試劑盒包含了標(biāo)記，封閉，雜交和檢測所需要的所有試劑，是真正意義上的一站式服務(wù)的試劑盒，提供您DIG標(biāo)記和檢測實驗需要的所有產(chǎn)品。它們之間的差別在于檢測方法的不同：Starter Kits I采用了顯色法，使用LE NBT/BCIP；而Starter Kits II選用化學(xué)發(fā)光法底物CSPD。詳細(xì)的DNA雜交探針標(biāo)記方法，可參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DIG Application Manual for Filter Hybridization 88頁。RNA 的標(biāo)記和檢測（Northern Blotting）    在Northern blotting中即可以使用DNA探

3、針，也可以使用RNA探針。通常，RNA探針的特異性和靈敏度度都會更高一些；當(dāng)然如果對靈敏度和特異性沒有特別嚴(yán)格的要求的話，DNA探針會更方便操作。    如果您需要制備RNA探針的話，推薦您使用Northern Starter Kit。該試劑盒以線性的DNA為模板，通過SP6, T7或是T3 RNA聚合酶的作用將DIG-11-UTP摻入到轉(zhuǎn)錄的RNA中，借助化學(xué)發(fā)光底物CDP-Star檢測。另一個產(chǎn)品DIG RNA Labeling Kit也可用于RNA探針的標(biāo)記。想了解詳細(xì)的RNA探針的使用及完整的Northern Blot操作過程，參考可參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DI

4、G Application Manual for Filter Hybridization 98頁。標(biāo)記探針的定量     盡管DIG系統(tǒng)的靈敏度很高，為了獲得理想的實驗結(jié)果，標(biāo)記探針和模板的用量是很重要的。同樣在每次標(biāo)記實驗后，通過spot test檢測探針的標(biāo)記效率也是非常重要的，可用以準(zhǔn)確計算雜交實驗中的探針用量。雜交實驗中探針用量的不準(zhǔn)帶來的影響是顯而易見的：探針的用量太多會帶來太多的背景問題，而探針的用量過少，則又會導(dǎo)致雜交信號太弱。Table 1中列出了一般雜交式樣中建議使用的DIG標(biāo)記探針的使用量。DIG系統(tǒng)的優(yōu)勢就在于：DIG PCR探針的產(chǎn)量可以

5、通過凝膠電泳的方式來定量。RNA 探針則可以檢測到探針的完整性。關(guān)于詳細(xì)的探針標(biāo)記效率直接測定的方法請參閱相應(yīng)的產(chǎn)品說明書以及可參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DIG Application Manual for Filter Hybridization 79頁。雜交溫度雜交條件的優(yōu)化取決于雜交片段的類型以及GC含量。RNA-RNA和RNA-DNA間的雜交溫度就要比DNA-DNA間的高。總體來說，不同片段間的雜交作用力RNA-RNA>RNA-DNA>DNA-DNA。因此做為一個通常的規(guī)律，以40GC含量的哺乳動物目的片段為例，在DIG Easy Hyb (DIG系統(tǒng)專用，無毒，絕對不含DNase

6、、RNase和任何的污染物) 或是50甲酰胺存在環(huán)境下的雜交溫度分別是：è DNA-DNA: 3742è DNA-RNA: 50è RNA-RNA: 68靶核酸的膠上樣量由于DIG系統(tǒng)的高靈敏度的特點，靶核酸的膠上樣量要小于其他的系統(tǒng)（Table 2）。同時DIG系統(tǒng)匹配的陽離子的尼龍膜也為DIG標(biāo)記的雜交檢測實驗提供了最強的信號和最低的背景影響。檢測方法對于探針和靶序列間形成的雜交子的檢測通常使用堿性磷酸酶耦聯(lián)的抗體，采用顯色或化學(xué)發(fā)光法檢測（table 3）。在眾多的堿性磷酸酶的底物中，我們推薦使用CDP-Star或CSPD用于化學(xué)發(fā)光檢測，NBT/BCIP用

7、于顯色反應(yīng)。此外對于膜雜交中的化學(xué)發(fā)光信號的檢測，建議使用Lumi-Film以獲得最理想的信號。詳細(xì)的操作過程，請參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DIG Application Manual for Filter Hybridization110或119頁。此外對于膜雜交中的化學(xué)發(fā)光信號的檢測，建議使用Lumi-Film以獲得最理想的信號。探針的撥離和重探詳細(xì)的操作過程，請參考羅氏應(yīng)用科學(xué)部DIG Application Manual for Filter Hybridization127頁。檢測底物è即用型CDP-Star堿性磷酸酶作用于CDP-Star底物，產(chǎn)生的光信號被X膠片曝光或是圖像設(shè)備

8、采集。與CSPD相比較，CDP-Star的主要特點在于由于光信號產(chǎn)生的速度更快（10倍于CSPD）同時強度更強，可大量縮短曝光時間。其信號的釋放可以持續(xù)大概兩天的時間，因此可以進行多次曝光?；瘜W(xué)發(fā)光的底物僅僅適用于尼龍膜。è即用型CSPD堿性磷酸酶作用于CSPD底物，產(chǎn)生的光信號可被X膠片（例如：Lumi-Film）或是圖像設(shè)備采集。由于其同樣具有持續(xù)的發(fā)光過程，因此也可以進行多次曝光。在尼龍膜上使用CSPD或CDP-Star底物的雜交，還可進行探針的剝離和重探。èNBT/BCIP使用類似NBT/BCIP顯色底物的好處就在于，檢測的過程中不再需要X膠片，既可以使用尼龍膜也可

9、以是使用硝酸纖維素膜。然而，如果想要獲得高靈敏度的檢測結(jié)果，可能就需要較長的時間了（幾個小時）。這種方法也有其不足之處：首先通過這種方法只能一次性獲得信號，不能多次檢測；在探針剝離前，需要使用二甲基甲酰胺先將膜上沉淀的顏色去除。è其他的底物和抗體在整個DIG系統(tǒng)中，還有其他的一些底物和多種熒光抗體，例如Fast Red Tablets, BM Purple, HNPPFluorescent Detection Set)和DAB POD Substrate ；供不同研究的需要。實驗數(shù)據(jù)與放射性探針標(biāo)記檢測技術(shù)的比較：第一，放射性探針的檢測時間需要18h，而DIG標(biāo)記系統(tǒng)的檢測時間僅需要15min；第二，使用DIG 標(biāo)記的探針在panel B上檢測到的兩