ELISA雙抗體夾心法

1、ELISA雙抗體夾心法點(diǎn)擊次數(shù)： 320  作者：百奧邁科 發(fā)表于：2009-03-13 16:18轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自丁香園 1、原理ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)反應(yīng)也結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。酶的催化效率很高

2、，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。2、特點(diǎn)某些分泌型蛋白，用siRNA 干擾后可以用ELISA 進(jìn)行檢測(cè)。3、ELISA 實(shí)驗(yàn)流程示圖（以雙抗體夾心法為例） 4、試劑與耗材（1） 包被緩沖液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液）：（2）洗滌緩沖液 （pH 7.4，0.15 M PBS）：（3）稀釋液：（4）終止液（2 M H2SO4）：（5）底物緩沖液 （pH 5.0）：（6）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）使用液：（7）2，2-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：（8）抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體：按說(shuō)明書(shū)處理。（9）標(biāo)準(zhǔn)品：用稀釋液稀釋成梯度濃

3、度溶液。（10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶標(biāo)板）。2、實(shí)驗(yàn)步驟（雙抗體夾心法）：（1）包被：用包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10 g/mL。在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加0.1 mL，4過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。（2）加樣：加一定濃度稀釋的待檢樣品（同時(shí)做空白對(duì)照，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照）0.1 mL 于上述已包被的反應(yīng)孔中，置濕盒中，37， 1 hr。用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。（3）加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體 （經(jīng)滴定后的稀釋度） 0.1ml。37，0.5 - 1 hr，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。（4）加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ，10 - 30min。（5）終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入終止液0.05 mL。（6）結(jié)果判定：將酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀上，于450 nm （若ABTS 顯色，讀410 nm），讀數(shù)，輸出到Excel 中。（