植酸酶的檢測方法-飼用植酸酶活性的測定

1、飼用植酸酶活性的測定 分光光度法1 范圍本標準規(guī)定了以分光光度法測定飼用植酸酶活性的方法。 本標準適用于作飼料添加劑用的植酸酶產品，也適用于添加有植酸酶的配合飼料、濃縮飼料和添加劑預混合飼料。樣品最低檢出量為90Ukg。2 引用標準 下列標準所包含的條文，通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時，所示版本均為有效。所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準的最新版本的可能性。 GBT 66821992 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法(neq ISO 3696：1987)3 植酸酶活性單位定義 樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmolL、溫度37、PH值5.00的條件下，每分鐘從

2、植酸鈉中釋放1mol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。4 方法原理 植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解底物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會生成黃色的(NH4)3PO4NH4VO316MoO3復合物，在波長415nm下進行比色測定。5 試劑和溶液 本標準中所用試劑，在沒有注明其他要求時，均指分析純試劑和符合GBT 6682中規(guī)定的三級水。 清洗試驗用容器不要用含磷清洗劑。5.1 0.25molL 乙酸緩沖液(I)稱取34.02g三水乙酸鈉于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸調節(jié)pH至5.000.01，并用蒸餾水定容至1000mL，室溫下存放

3、2個月有效。5.2 0.25molL乙酸緩沖液()稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5g TritonX-100,牛血清白蛋白（BSA）于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸調節(jié)pH至5.000.01，并用蒸餾水定容至1000mL，室溫下存放2個月有效。5.3 植酸鈉溶液 c(C6H6O24P6Na12)為7.5mmolL稱取0.6929g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL。容量瓶中，用0.25molL乙酸緩沖液(5.1)溶解并定容至刻度，用冰醋酸調節(jié)pH至5.000.01，現(xiàn)用現(xiàn)配(實際反應液中的最終濃度為5.0 mmolL)。5.4 硝酸溶液：1+2水溶液

4、。5.5 100gL鉬酸銨溶液稱取10g鉬酸銨(NH4)6Mo7O244H2O于100mL。容量瓶中，加入1.0mL氨水(25)用水溶解定容至刻度。5.6 2.35 gL釩酸銨溶液稱取0.235 g釩酸銨(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL硝酸溶液(5.4)，用水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。5.7 顏色終止液移取2份硝酸溶液(5.4)，1份鉬酸銨溶液(5.5)，1份釩酸銨溶液(5. 6)混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。(注意：不要有白色乳狀沉淀，加硝酸要慢)5.8 植酸酶標準品(標明準確活性單位和類型)。5.9 磷酸二氫鉀(KH2PO4)：基準物。6 儀器和設備6.1 實驗

5、室常用儀器設備。6.2 恒溫水?。?370.1)。6.3 分光光度計：有10mm比色皿，可在415nm下測定吸光度。6.4 磁力攪拌器。6.5 渦流式混合器。6.6 酸度計：精確至小數(shù)點后2位。6.7 離心機：轉速為4000rmin以上。7 試樣制備 取有代表性樣品，用四分法將試樣縮分至200g，植酸酶產品不需粉碎，配合飼料和添加劑預混合飼料需粉碎通過0.45mm標準篩，裝入密封容器，防止試樣成分變化。8 測定步驟8.1 絕對法(仲裁法)8. 標準曲線 準確稱取0.6804g在105烘至恒重的基準磷酸二氫鉀(5.9)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(5.2)溶解，并定容至100mL濃度為50

6、.0mmolL。按表1的比例稀釋成不同濃度，與試樣一起反應測定，以無機磷濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，列出直線回歸方程(yax+b)。 表1標準序號稀釋量mL濃度(mmolL)10.512520.5212.530.546.2540.583.12550.5161.562 5 試樣溶液的制備 按照附錄A中建議的稱樣量稱取試樣兩份，精確至0.0001 g，置于100 mL容量瓶中，加入約70mL乙酸緩沖液()，一個磁力棒，在磁力攪拌器(6.4)上高速攪拌30min，用乙酸緩沖液(5.2)定容至刻度(減去磁力棒的體積)。搖勻，在離心機(6.7)上以4 000rmin離心10min。分取不同體積的上清液

7、用乙酸緩沖液(5.2)稀釋（一般取2ml上清夜到50ml容量瓶中），使樣液濃度保持在UmL。左右，待反應。 建議在測定樣品時附加一個已知活性的植酸酶參考樣，便于檢驗整個操作過程是否有偏差。以玉米芯、麩皮等為載體時可提高緩沖液5.2中TritonX-100及BSA的濃度至0.5% 反應 取10mL試管按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底物(5.3)開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，37水解30min。 反應步驟及試劑、溶液用量見表2。 表2 反應順序樣品、標準樣品空白(標準空白)1.加乙酸緩沖液(5.1或5.2)1.8 mL1.8 mL(2.0 mL)0.2 mL0.2

8、 mL437預熱5 min5.依次加入底物(5.3)4 mL4 mL(第二步)水解30min8.依次加入終止液(5.7)4 mL4mL(第一步)總體積10 mL10 mL 樣品測定 反應后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(6.7)上以4 000rmin離心10min，上清液以標準曲線的空白調零，在分光光度計(6.3)415 nm波長處測定樣品空白(A。)和樣品溶液(A)的吸光值，A-A0。為實測吸光值。用直線回歸方程計算植酸酶的活性。9 結果計算和表示9.1計算公式試樣中植酸酶的活性,用每克(或ml)試樣中的活性單位“U”表示, 計算公式如下： 絕對法U(1)式中：U試樣中植酸酶的活性，UgC根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸萬程計算出的x值，U；F試樣溶液反應前的總稀釋倍數(shù)。m試樣質量，g或mL30反應時間，min9.2 結果表示 兩個平行樣品的測定結果用算術平均值表示，保留整數(shù)。9.3 重復性 同一樣品兩個平行測定值