反相高效液相色譜法測定鹽酸博安霉素含量_圖文

1、.30. 中國抗生素雜志2011年1月第36卷第1期 文章編號:10018689(2011Ol一0030-03反相高效液相色譜法測定鹽酸博安霉素含量魯敏1許鴻章I尹利輝2張瑞I陳汝賢I+(1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究所,北京100050:2中國藥品生物制品檢定所,北京100050摘要:目的 建立反相高效液相色譜法測定博安霉素含量的方法。方法采用AgilefIt ZORBAX Eclipse PhsC。(4.6n-anX 150hen, 5岬色譜柱,流動相為0.005mol/L己烷磺酸鈉離子對溶液(pH4.3:甲醇:乙腈(72:21:7,柱溫22"(2,流速ImL/

2、min,檢測波長 254nm。結(jié)果 博安霉素在0.0752.4mg/mL范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R=0.9999。結(jié)論此方法操作簡 便、快捷、準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,既可以用于博安霉素產(chǎn)品的質(zhì)量分析,也可用于生產(chǎn)中間品的質(zhì)量控制。與平陽霉素檢測方法相 比,采用此方法博安霉素與博萊霉素族其他組分的分離效果更好。關(guān)鍵詞:反相高效液相色譜;博安霉素;平陽霉素;博萊霉素中圖分類號:R927.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼:AContent determination of boanmycin hydrochloride by RP-HPLCLu Minl,Xu Honezhan91,Yin Li-hui2,

3、Zhang Ruil and Chen Ruxianl(1Institute ofMedicinal Biotechnology&Peking Union Medical College,Chinese Academy ofMedical Sciences,Beijing 100050; 2National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050Abstract 0bi ective To establish all RPHPLC method for dete

4、rmination of the content of boanmycin. Methods T11e HPLC condition was弱follows,column,Agilent ZORBAX Eclipse PlusCIR(4.6mmx 150mm,5pro;temperature,22:mobile phase,0.005mol/L sodium 1.hexanesulfonate(pH adjusted to 4.3:methanol:acetonitrile (72:2l:7、:flow rate:1.0mL/min;UV detection wave length,254nm

5、.Results The calibration curve for peak area of boanmycin was Iinear from 0.075to 2.4mg/mL(尺=0.9999.Conclusion The method iS simple,quick,accurate, reproducible and suitable for quality analysis of boanmycin and quality control ofintermediate.The resolution of boanmycin from other components of bleo

6、mycin family was bener than that of pingyangmycinS test method by this method.Key words RP.HPLC;Boanmycin;Pingyangmycin;Bleomycin博安霉素(boanmycin是一個新的抗腫瘤抗生 素,國家一類新藥,是從我國浙江的土壤中分離得 到的一株鏈霉菌(輪枝鏈霉菌平陽變種產(chǎn)生的博萊霉 素類抗腫瘤物質(zhì)【】。我國從60年代末就開始了對博萊 霉素類的研究和開發(fā),時稱爭光霉素,其中第一大 組分平陽霉素(博萊霉素A5單組分已于80年代初投 產(chǎn),并收入國家藥典和國家基本藥物,在腫瘤臨床 化療

7、上發(fā)揮了很好的作用。博安霉素是我們繼平陽 霉素之后開發(fā)的又一個新的抗腫瘤抗生素,它最大 的優(yōu)點(diǎn)是肺毒性顯著低于平陽霉素和博萊霉素,除 對頭頸部癌、皮膚癌、肺癌、食管癌、淋巴癌有較 好作用外,對肝癌也有較好的療效,現(xiàn)已正式投產(chǎn) 進(jìn)入市場。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與博萊霉素A6一致fl】。由于博安霉素與博萊霉素族的其他產(chǎn)品一樣均收稿日期:2010-03-01基金項目:“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(編號:2009zx 09301-003作者簡介:魯敏,女,生于1960年,副主任技師,主要從事微生物及天然產(chǎn)物的分離提取工作。通訊作者,E-mail:chrx888sohu.corn反相高效液相色譜法測定鹽酸博安霉素含

8、量魯敏等 .31. 為微生物發(fā)酵產(chǎn)物,又具有結(jié)構(gòu)上的相似性,所以在含量測定上有一定的困難。日本曾用CM.sephadex c.25NH4+】柱層析法進(jìn)行梯度洗脫,分份收集樣品, 測定紫外吸收度,以此計算各組分的含量,此方法 既繁瑣又費(fèi)時,且不適合于測定純度較差的復(fù)合 物,無法進(jìn)行生產(chǎn)過程中間產(chǎn)品的質(zhì)量控制。美國藥典UsP28-NF23【21和有關(guān)文獻(xiàn)【3噌報道用反 相離子對梯度洗脫法測定博萊霉素復(fù)合物的組分, 流動相用離子對試劑戊烷磺酸鈉與甲醇進(jìn)行梯度洗 脫,但一次測定需要80min。中國藥典1995年版中平 陽霉素的含量測定方法也采用HPLC法,但改梯度洗 脫為固定比例洗脫41。在博安霉素生

9、產(chǎn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立 時,關(guān)于博安霉素的含量測定,我們借鑒了平陽霉 素含量測定的方法【5】,考察了不同流動相比例和不同 pH對檢測結(jié)果的影響,對分析條件作進(jìn)一步改進(jìn), 最終將戊烷磺酸鈉改為己烷磺酸鈉,并調(diào)整流動相 比例,達(dá)到了與博萊霉素族其他組分的良好分離。 l儀器與試藥島津液相色譜儀(LC.10AT泵,SPD.M10A-極管 陣列監(jiān)測器,COT-10A柱溫箱,Clase.vpT作站。 博安霉素對照品(天津太河制藥公司提供。己烷磺酸 鈉離子對試劑:天津試劑二廠生產(chǎn),0.25mol/L,每 支20raL。2色譜條件色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C。 (4.6mmX 1

10、50mm,5郵吣;流動相比例:0.005mol/L己 烷磺酸鈉溶液:甲醇:乙腈(72:21:7;柱溫22; 流速lmL/min;檢測波長254nm。0.005mol/L己烷磺酸 鈉離子對溶液配制:取己烷磺酸鈉離子對試劑一支, 加975mL水和5mL冰醋酸,用氨水調(diào)pH4.3。3方法與結(jié)果3.1線性考察15010050O3一芝囂陋圖1博安霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve ofboanmycin精密稱取博安霉素對照品60mg置于25mL容量 瓶中,加水定容至刻度搖勻作為儲備液,然后取 一定量儲備液對倍稀釋制得濃度為2.4、1.2、0.6、 0.3、0.15和0.0750mg/m

11、L的系列溶液進(jìn)樣測定, 采用外標(biāo)法面積定量。結(jié)果以樣品濃度(mg/mL 對色譜峰面積進(jìn)行線性回歸見圖l,得回歸方程為 Y-1.0×107X+125076,R=0.9999。再將樣品逐級稀 釋,當(dāng)樣品濃度為0.41上g/mL時,信噪比(S/N約為3, 得檢測線。3.2精密度和重復(fù)性試驗(yàn)取一定量儲備液配SUo.6mg/mL 5份,取一份連 續(xù)進(jìn)樣5次,RSD為0.89%,說明其重復(fù)性良好。用 上述樣品在O、l、2、4、6、8h進(jìn)樣,其余樣品置于 冰箱內(nèi)分別在24、48、72、96h進(jìn)樣,得日內(nèi)精密度 和日間精密度RSD分別為1.3%和0.87%,均能達(dá)到方 法學(xué)的要求。3.3分離度我們把

12、博安霉素、平陽霉素、博萊霉素(A2、B2的混合品、博萊霉素B4混合進(jìn)樣,博安霉素與其他 組分的分離度均可以達(dá)到1.5,見圖2。3.4樣品測定精密稱取博安霉素對照品15.2mg置于25mL容量 瓶中,加水定容至刻度搖勻作為對照液,其含量以O(shè) lO 15202530 t/minl:博萊霉素A2;2:平陽霉素;3:待鑒定組分;4;博萊霉素B2:5:博安霉素:6博萊霉素B4圖2博萊霉素族的HPLC圖Pig.2High performance liquid chromatography(HPLCof bleomycm family.32. 中國抗牛素雜志2011年1月第36卷第1期 中國抗生素雜志201

13、1年1月第36卷第1期表l不同批次樣品含量測定結(jié)果Tab.1Results ofdifferent batches ofsamples無水物計算含博安霉素游離堿78.6%,另外分別稱取 不周批號的樣品以同法配制成待測液,分別平行進(jìn) 樣3次,用外標(biāo)法以峰面積計算其含量,見表l。 4討論關(guān)于含量,在博安霉素生產(chǎn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定,“以無水物計算含鹽酸博安霉素fH晰N2。02。s2nHO, 不低于85%”。雖然每Imol/L鹽酸博安霉素中理論上 應(yīng)含6mol/L鹽酸,但實(shí)際生產(chǎn)工藝中通過調(diào)節(jié)溶液 pH值4.56.5來保t正￥11劑處于穩(wěn)定狀態(tài),故鹽酸的數(shù) 目為變量,根據(jù)中國藥典的慣例,含量以活性成分計

14、算,按每Imol/L鹽酸博安霉素理論上含6mol/L鹽酸計 算,鹽酸博安霉素中博安霉素的理論含量為87.3%, 由于實(shí)際生產(chǎn)成品中鹽酸的數(shù)目為變量,為了控制 生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定了含量的上下 限,為理論值的下限85.0%(85.O%×87.3%=74.2%, 理論值的上限105.0%(105.0%×87.3%=91.7%,即 “按無水物計算,含博安霉素(C。H,。N:。02。S:應(yīng)為 74.2%91.7%”。另外在博安霉素的HPLC研究中,我們發(fā)現(xiàn)在流 動相比例及流速一定的條件下溫度的變化對色譜峰 有很大的影響。當(dāng)溫度為20至1J25時博安霉素色 譜峰為單峰,高于

15、30時色譜峰將呈現(xiàn)雙峰,當(dāng)溫 度升到60色譜峰又變成單峰,但已不是原來的單 峰,而是隨溫度提高新出現(xiàn)的單峰,這種變化可能 與博安霉素本身的質(zhì)子化程度或構(gòu)象有關(guān)。為了保 證含量測定的準(zhǔn)確性我們通常把柱溫控制在22。 由于將離子對試劑改為己烷磺酸鈉,取得了較 采用戊烷磺酸鈉更好的分離度,使得博安霉素與博 萊霉素族其他組分的分離效果更好。這樣,該方法 不但用于博安霉素產(chǎn)品的定量,而且可以用于生產(chǎn) 過程中間體的分析。值得注意的是流動相中己烷磺 酸鈉的pH值為4.3,要準(zhǔn)確調(diào)整,因?yàn)閜H值的微小變 化會影響到分離度。實(shí)驗(yàn)證明,用我們建立的高效液相色譜法檢測 博安霉素的含量,操作簡便快速,準(zhǔn)確度高,重現(xiàn) 性好,既可以用于博安霉素產(chǎn)品的質(zhì)量分析,也可 用于生產(chǎn)中間品的質(zhì)量控制。參考文獻(xiàn)f11許鴻章,戴麗華,張鶴鏞,等.爭光霉素A6和它在爭光霉素 復(fù)合物中的地位J】.藥學(xué)學(xué)報,1988,28(9:667671. 【2】The United States Pharmacopeial Convention,lne. USP28一NF23S.Canada by Webcom Limited,Toronto, Ontario,2005:271.【3】Klea R P'Chovan J P,Dansc I H R.Reversedphase paired-ion highper