畢赤酵母搖瓶產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

1、畢赤酵母搖瓶產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化孫愛萍 1 諶曉華 1 賈 偉 1 萬紅貴 2(1. 江西誠志生物工程有限公司 , 江西 鷹潭 335000;2. 南京工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院 , 江蘇 南京 210009摘要 :對畢赤酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化 , 該菌產(chǎn)木聚糖酶的最佳碳源為麩皮 , 最佳氮源為酵母膏 ;搖瓶培養(yǎng)條件為 30 、 接 1種量 10%、 初始 pH5.間為 18h , 經(jīng)優(yōu)化后 , 木聚糖酶酶活達(dá)到 1765I 。關(guān)鍵詞 :畢赤酵母 木聚糖酶 自然資源 ,-1,4-木糖苷鍵 , 可將木聚 糖水解為木二糖和木二糖以上的低聚木糖 12, 以及 少量木糖和阿拉伯糖

2、 , 在飼料 、 造紙 、 食品及生物轉(zhuǎn)化 等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景 36。產(chǎn)木聚搪酶的微生 物分布很廣包括細(xì)菌 、 放線菌 、 真菌以及某些酵母 , 而 國內(nèi)對酵母菌產(chǎn)酶的研究較少 , 本文重點(diǎn)研究了搖瓶 條件下的最佳發(fā)酵條件 。1 材料與方法1. 1 菌種 巴斯德畢赤酵母基因工程菌 , 由南京工業(yè) 大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存1. 2 主要材料樺木木聚糖 購自 S igma 公司 ;DNS (3,5-硝基水 楊酸 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 ;麩皮為南京市郊區(qū)購得 ; 其他試劑為國產(chǎn)分析純 ; 1. 3 主要設(shè)備HYG-A 全溫?fù)u床柜太倉設(shè)備廠 ;pHS -3C 精密 pH 計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公

3、司 ; S pectrum L752s 紫 外可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司1. 4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法將種子液接入裝有 50m L 的發(fā)酵培養(yǎng)基的 500m L 搖瓶中 ,8層紗布封口 , 置于旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩培養(yǎng) 。 所有試驗(yàn)重復(fù) 3次 , 取平均值 。1. 5 酶活國際單位 (I U 定義在本試驗(yàn)條件下 , 以木糖為標(biāo)準(zhǔn) , 在溫度為 70 、 pH 為 6. 0的最適酶促反應(yīng)條件下 , 以每 1min 生成 1m ol 還原糖所需的酶量作為一個(gè)酶活力單位 , 為 1個(gè) 國際單位 (I U 。1. 6 酶液的制備畢赤酵母液體培養(yǎng)發(fā)酵液 , 經(jīng) 8000r/min 離心 15 min

4、的上清液并適當(dāng)稀釋即為本實(shí)驗(yàn)所用酶液 。1. 7 酶活測定方法參照 DNS 法 7, 取稀釋酶液 0. 1m L , 加 1%木聚糖 0. 9m L , 置 70 水浴保溫 10min 然后加入 DNS 試劑 3 m L 于沸水浴中顯色反應(yīng) 5min , 迅速冷卻至室溫并加蒸 餾水定容至 20m L ,540nm 處比色測定 。2 結(jié)果與討論2. 1 碳源的選擇碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一 , 其主要功能 有兩個(gè) :一是為微生物菌種的生長繁殖提供能源和合 成菌體所必需的碳成分 ; 二是為菌體合成目的產(chǎn)物提 供所需的碳成分 。碳源物質(zhì)不僅能夠促進(jìn)菌體生長 , 而且外源基因 在表達(dá)過程中也需要消

5、耗較多的能量 。常用的碳源有 糖類 、 油脂 、 有機(jī)酸和低碳醇等 。本研究選用了不同的 碳源進(jìn)行產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn) , 結(jié)果見表 1。表 1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響碳源種類米糠 麥麩米糠 +麥麩葡萄糖 甘油 米糠酶活2. 3 氮源的選擇氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì) (氨基酸 、 蛋白 質(zhì) 、 核酸等 和含氮的目的產(chǎn)物 , 是構(gòu)成菌體細(xì)胞蛋白 和核酸的物質(zhì)來源 , 與培養(yǎng)過程中菌體得正常代謝有 著重要關(guān)系 。以麥麩為碳源 , 分別考察了有機(jī)氮源牛肉膏 、 酵母 浸膏 、 蛋白胨及無機(jī)氮源硫酸銨 、 尿素對酶活的影響 , 結(jié)果見表 2。96 2009年 3月 畢赤酵母搖瓶產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化 表 2 不

6、同氮源對產(chǎn)酶的影響氮源 種類 牛肉膏 酵母 浸膏 蛋白胨 酵母膏 +蛋白胨 尿素 硫酸銨 酶活(-1 796978528510217284 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出 , 有機(jī)氮源明顯優(yōu)于無機(jī)氮 源 , 其中酵母浸膏可使酶活接近 1000I U/ml , 加之牛肉 膏價(jià)格因素 , 因此選用酵母浸膏作為氮源進(jìn)行發(fā)酵 。 2. 3 正交試驗(yàn)通過 4因素 3水平的正交實(shí)驗(yàn)確定搖瓶中畢赤酵 母產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件 , 正交設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 3和表 4表 3 因素 、 水平表 水平溫度 A接種量 D164. 50. 5%2105. 51. 0%根據(jù)正交試驗(yàn)表 L 9(34 進(jìn)行正交試驗(yàn) , 結(jié)果見表 4。運(yùn) 用

7、極差分析方法可知 :4個(gè)因素影響產(chǎn)酶的主次順序?yàn)?R C >R D >R A >R B , 也就是 pH 是影響產(chǎn)酶的主要因子 , 接種量影響最小 。表 4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 實(shí)驗(yàn)號(hào)溫度接種量pH 甲醇 濃度 實(shí)驗(yàn) 結(jié)果 1 均值 11199. 6671216. 6671159. 6671158. 333均值 21283. 6671242. 3331391. 6671323. 667均值 31165. 0001189. 3331097. 0001166. 333圖 1 因素 、 水平與產(chǎn)酶的關(guān)系 (趨勢圖 因素 、 水平與產(chǎn)酶的關(guān)系 (趨勢圖 見圖 1, 由圖可知 , 因素

8、 A 中以 A 2的 k 值最高 ,B 中為 B 2,C 中為 C 2,D 中為 D 2, 所 以 優(yōu) 勢 水 平 組 合 為 A 2B 2C 2D 2。即 溫 度 為30 、 接種量為 10%、 初始 pH5. 5、 初始甲醇含量 1. 0%, 以此組合進(jìn)行試驗(yàn) ,3次重復(fù) , 得到結(jié)果為 1653I U/ml -12. 4 甲醇誘導(dǎo)時(shí)間的研究畢赤酵母在誘導(dǎo)表達(dá)階段 , 甲醇作為誘導(dǎo)物的同 時(shí)又是碳源和能源 。 分別選擇發(fā)酵開始后的 0、 18、 24、 36、 48h , 以觀察最佳的誘導(dǎo)時(shí) 間 , 結(jié)果如圖 2。 18h 后開始進(jìn) , 由 , , 而如果誘導(dǎo)時(shí)間較晚也 , 可能是因?yàn)榧状?/p>

9、誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中 , 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長 , 目的蛋白表達(dá)量也逐漸增多 10, 因此確定 18h 為甲醇誘導(dǎo)開始時(shí)間 。圖 2 甲醇誘導(dǎo)時(shí)間對產(chǎn)酶的影響2. 5 畢赤酵母木聚糖酶耐熱性通常不同菌種來源的木聚糖酶其最適反應(yīng)溫度是不同的 。由圖 2-5可以看出 , 本研究獲得的木聚糖酶 在 70 時(shí)酶活最高 , 且該酶在 80 時(shí)仍然具有較高的 活力 , 這在已報(bào)導(dǎo)的畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)酶中是最耐熱的 , 具備工業(yè)化耐高溫酶制劑的要求 。圖 3 溫度對酶活性的影響注 :以反應(yīng)溫度 50 的測定值為 100%7江 西 化 工 2009年第 1期 3 小結(jié)本研究通過對畢赤酵母菌株產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件 進(jìn)行了研究

10、 , 得到該工程菌最佳碳源為麩皮 , 最佳氮源 為酵母膏 , 通過正交實(shí)驗(yàn)得到工程菌的最佳搖瓶培養(yǎng) 條件為 30 、 接種量 10%、 初始 pH5. 5、 初始甲醇含量 1. 0%, 并確定了甲醇最佳誘導(dǎo)時(shí)間為 18h 。該酶的耐 熱穩(wěn)定最高為 70 。參考文獻(xiàn)1G eorgi T odorov D obrev , lvan G enov Pishtiyski , VeselinS tanchev ,et al. Optimization of nutrient medium containing agricultural wastes for xylanase production by

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