茅蒼術(shù)藥材高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)指紋圖譜的研究

1、茅蒼術(shù)藥材高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)指紋圖譜的研究        【摘要】     目的研究茅蒼術(shù)的HPLC-ELSD指紋圖譜。方法高效液相色譜法，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)，水（0.25%乙酸）-乙腈梯度洗脫；流速0.6 ml/min；柱溫30。ELSD條件：不分流；漂移管溫度112.8；空氣流量3.1 L/min。結(jié)果共有10個(gè)共有峰，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）得出了茅蒼術(shù)藥材的對(duì)照指紋圖譜。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中各共有峰相對(duì)保

2、留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3。結(jié)論 該指紋圖譜方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，為有效地控制茅蒼術(shù)藥材的內(nèi)在質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。     【關(guān)鍵詞】  茅蒼術(shù) 指紋圖譜 高效液相色譜 蒸發(fā)光散射    蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea (Thunb.) DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis (DC.) Koid Z.的干燥根莖1。始載于神農(nóng)本草經(jīng)，蒼術(shù)性辛、苦、溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目作用。主治脘腹脹滿、泄瀉、水腫、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒等，

3、中醫(yī)臨床使用歷史悠久。其中尤以產(chǎn)于江蘇茅山地區(qū)的茅蒼術(shù)品質(zhì)最好。茅山地區(qū)是茅蒼術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)。但近年來(lái)國(guó)際市場(chǎng)對(duì)蒼術(shù)的需求量日益增加，茅蒼術(shù)被掠奪性采挖，加之對(duì)茅蒼術(shù)生態(tài)環(huán)境的人為破壞，造成茅蒼術(shù)資源的枯竭，使其瀕于滅絕2。為了保護(hù)這一珍貴資源，需對(duì)其優(yōu)良品質(zhì)進(jìn)行分析。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)茅蒼術(shù)傳統(tǒng)意義上的活性部位揮發(fā)油的研究，未發(fā)現(xiàn)與道地性的直接聯(lián)系，所以我們選取了茅蒼術(shù)的水溶性部分進(jìn)行初步的指紋圖譜的研究。由于茅蒼術(shù)水溶性部位含有的主要成分為無(wú)紫外吸收單萜苷類，故選用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，獲得了良好而穩(wěn)定的結(jié)果。按照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2000年頒發(fā)的“中藥注射劑指紋圖譜技術(shù)要求”的有關(guān)規(guī)定3，對(duì)產(chǎn)

4、于江蘇茅山地區(qū)的不同采集地點(diǎn)的10批茅蒼術(shù)進(jìn)行了HPLCELSD指紋圖譜方法的建立。建立其指紋圖譜是為了反映其質(zhì)量情況，為建立穩(wěn)定、可靠、全面的質(zhì)量控制方法提供科學(xué)依據(jù)。1  材料與儀器1.1  樣品本實(shí)驗(yàn)植物樣品包括茅蒼術(shù)Atractylodes. lancea (Thunb.) DC.10份，南蒼術(shù)2份，北蒼術(shù)、白術(shù)各1份，其編號(hào)、采摘地點(diǎn)及采摘時(shí)間等見表1。樣品采收后洗凈切小塊，在55下烘干備用。1.2  對(duì)照品蒼術(shù)苷A，3，4，11，14-四羥基愈創(chuàng)-9-烯-11-O-D-吡喃葡糖苷，純度98，本課題組分得。1.3  試劑及儀器乙腈：HPLC級(jí)；

5、乙酸：AR級(jí)；去離子水。Agilent 1100液相色譜儀，HP Chemstation色譜工作站，Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光檢測(cè)器，Agilent INTERFACE 35900E 數(shù)模轉(zhuǎn)換器，XWK-無(wú)油空氣泵，Phenoxmenex Synergi Hydro-RP 80A柱（4.6 mm×250 mm，4 m）加C18預(yù)柱。2  方法2.1  色譜條件經(jīng)方法學(xué)研究確定色譜條件，流動(dòng)相A：水（含0.25%乙酸），B：乙腈。梯度洗脫程序見表2。柱溫30；流速0.6 ml/min；進(jìn)樣量：30 l。ELSD采用不分流模式，漂移管溫度112.8，

6、空氣流量：3.1L/min。表1  植物樣品的采集情況（略）表2  梯度洗脫程序（略）2.2  供試液制備取如上干燥植物樣品，粉碎，過(guò)40目篩。精密稱定2 g，置索氏提取器中，加80 ml正己烷水浴加熱回流脫脂8 h。棄去正己烷液，取出樣品紙包待正己烷揮發(fā)至干，再加80 ml甲醇提取8 h。將甲醇提取液減壓蒸至小體積，甲醇定容至10 ml，用0.45 m微孔濾膜濾過(guò)后備用。2.3  參照物標(biāo)準(zhǔn)液制備精密稱取蒼術(shù)苷A，3，4，11，14-四羥基愈創(chuàng)-9-烯-11-O-D-吡喃葡糖苷對(duì)照品，甲醇定容配成2.94及1.00 mg/ml的原液備用。2.4

7、0; 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取茅蒼術(shù)04號(hào)樣品供試液，分別在0，4，8，12，24 h檢測(cè)指紋圖譜。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值基本一致，RSD3，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜技術(shù)要求。2.5  精密度實(shí)驗(yàn)取茅蒼術(shù)03號(hào)樣品供試液，連續(xù)進(jìn)樣5次，檢測(cè)指紋圖。比較各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD3，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。2.6  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取茅蒼術(shù)09號(hào)樣品5份，按供試品溶液制備方法制備供試品，檢測(cè)指紋圖。并分別按上述液相條件測(cè)定，對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，5份供試品溶液的RS

8、D3，符合指紋圖譜的要求。2.7  樣品測(cè)定精密吸取供試品溶液各30 l，注入液相色譜儀，按“2.1”中色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以蒼術(shù)苷A（S峰）的保留時(shí)間及峰面積為1，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值。并按“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求”建立茅蒼術(shù)藥材的指紋圖譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。3  結(jié)果3.1  相對(duì)保留值指紋譜的建立采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定指紋峰，記錄80 min的色譜圖，以圖譜中蒼術(shù)苷A（3號(hào)峰）為參照物（S），將各指紋峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間（設(shè)定為1）比較，其比值為各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間。計(jì)算10批藥材指紋圖譜中各指紋峰的技術(shù)參數(shù)（見

9、表3），標(biāo)定茅蒼術(shù)的特征指紋峰為10個(gè)（見圖1）。各特征指紋峰的保留時(shí)間為：峰-1（23.432 min）；峰-2（26.383 min）；峰-3（30.468 min）；峰-4（43.478 min）；峰-5（44.682 min）；峰-6（50.365 min）；峰-7（52.176 min）；峰-8（63.336 min）；峰-9（65.065 min）；峰-10（70.435 min）。其中峰6為3，4，11，14-四羥基愈創(chuàng)-9-烯-11-O-D-吡喃葡糖苷。表3  茅蒼術(shù)指紋圖譜的技術(shù)參數(shù)（略）3.2  共有指紋峰面積的比值通過(guò)10批藥材測(cè)定，以圖譜中蒼術(shù)苷A為

10、參照物（S），將各特征指紋峰面積與同一圖譜中參照物的峰面積比較，其比值為特征指紋峰的相對(duì)峰面積。據(jù)“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求”規(guī)定，各共有指紋峰的面積比值必須相對(duì)固定。峰-4單峰面積占總峰面積百分比20，其差值20；峰-3單峰面積占總峰面積百分比10，而20，其差值25；其余單峰面積比均10，峰面積比值不做要求。符合指紋圖譜的要求。3.3  非共有峰面積通過(guò)10批藥材供試品的測(cè)定，統(tǒng)計(jì)非共有峰與總峰面積的百分比，其結(jié)果為非共有峰面積百分比7.07，符合指紋圖譜研究的10的檢測(cè)要求。3.4  相似度采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）對(duì)各樣品色譜圖的原始

11、文件（輸出格式為aia）進(jìn)行分析，自動(dòng)匹配并以10批樣品生成的對(duì)照譜圖（中位數(shù)法）作為對(duì)照模版，計(jì)算各色譜圖的整體相似度介于0.5640.887之間。見表4。表4  10批藥材相似度（略）3.5  其它藥材和茅蒼術(shù)HPLC-ELSD標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的比較在同樣條件下分別測(cè)定了產(chǎn)于湖北和安徽的南蒼術(shù)、北蒼術(shù)、白術(shù)藥材的色譜圖，并與茅蒼術(shù)HPLC-ELSD標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較相似度。結(jié)果見表5。圖1  典型茅蒼術(shù)HPLC-ELSD色譜圖（略）4  討論    蒼術(shù)為中醫(yī)常用藥，臨床應(yīng)用歷史悠久，具有健脾燥濕、祛風(fēng)散寒的功效，尤以產(chǎn)于江蘇

12、茅山地區(qū)的茅蒼術(shù)品質(zhì)最好，歷來(lái)認(rèn)為茅山是茅蒼術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)。對(duì)茅蒼術(shù)道地性的研究集中在對(duì)其揮發(fā)油的研究。大量實(shí)驗(yàn)證明道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)茅蒼術(shù)含油量有顯著性差異，且道地產(chǎn)區(qū)低于非道地產(chǎn)區(qū)，這提示我們茅蒼術(shù)的道地性可能不是體現(xiàn)在揮發(fā)油上，而是在水溶性成分中。日本學(xué)者在對(duì)茅蒼術(shù)的研究中，從其水溶性部分分得了大量的單萜苷類成分，且顯示具有較好的藥理活性?；谶@種原因，我們對(duì)茅蒼術(shù)的水溶性化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)分離，并對(duì)其指紋圖譜進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)水溶性部分成分多為沒(méi)有紫外吸收的單萜苷類成分，采用紫外檢測(cè)器在圖譜中基本看不到吸收峰，故本實(shí)驗(yàn)選用ELSD檢測(cè)器并獲得了滿意的結(jié)果。表5 

13、與其它藥材的比較結(jié)果（略）4.1  提取條件摸索  比較了甲醇、95乙醇、50甲醇、50乙醇等對(duì)樣品的提取效果，以甲醇提取的樣品液出峰較多，故選定甲醇做為提取溶劑。4.2  液相條件摸索  本實(shí)驗(yàn)采用ELSD檢測(cè)方式，ELSD檢測(cè)器能檢測(cè)到任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的化合物，因此溶劑中極微量的殘留成分也能檢測(cè)出來(lái)，造成峰的干擾或基線不穩(wěn)。在液相洗脫條件的摸索中，嘗試了使用甲醇水，乙腈水兩種溶劑系統(tǒng)。即使在使用高純度甲醇溶劑時(shí)，譜圖中仍有含量較大的雜峰，而在選用乙腈時(shí)雜峰較少，故選擇乙腈水做為梯度洗脫的溶劑系統(tǒng)。茅蒼術(shù)所含成分較復(fù)雜，給液相分離帶來(lái)了很大的困難，

14、通過(guò)加入一定的緩沖溶液可以大大的改善峰形，提高分離度。對(duì)幾種揮發(fā)性的緩沖溶液進(jìn)行比較，選定加入0.25%的乙酸。    所采集的10批藥材均為野生茅蒼術(shù)藥材，生長(zhǎng)年限等因素可能會(huì)對(duì)藥材的內(nèi)在質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響，所研究的指紋圖譜所表達(dá)的信息，僅代表茅蒼術(shù)藥材的整體情況，故而10批茅蒼術(shù)藥材的指紋圖的相對(duì)峰面積值變異較大。    10批茅蒼術(shù)藥材圖譜與茅蒼術(shù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度介于0.9650.855之間，產(chǎn)于湖北的南蒼術(shù)與茅蒼術(shù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度為0.867，顯示兩者有較接近的化學(xué)成分組成。產(chǎn)于安徽的南蒼術(shù)與茅蒼術(shù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度為0.73，明顯不如產(chǎn)于湖北的茅蒼術(shù)近，這與其它實(shí)驗(yàn)證明的結(jié)論相符。茅蒼術(shù)在茅山地區(qū)生長(zhǎng)具有較好的道地性優(yōu)勢(shì)，引種于湖北地區(qū)的茅蒼術(shù)道地性優(yōu)勢(shì)優(yōu)于其它地區(qū)。產(chǎn)于北京的北蒼術(shù)與茅蒼術(shù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度為0.236，顯示二者之間化學(xué)成分相差大，不能混用。白術(shù)與茅蒼術(shù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度為0.062，相似度最低。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-ELSD指紋圖譜為快速鑒定蒼術(shù)類藥材提供了依據(jù)。    本實(shí)驗(yàn)在中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）的輔助下，得到了茅蒼術(shù)藥材的H