脫氧核糖核酸電化學(xué)傳感器的原理及其應(yīng)用

1、脫氧核糖核酸電化學(xué)傳感器的原理及其應(yīng)用陸曉軍鞠先3(南京大學(xué)化學(xué)系,配位化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京210093摘要對(duì)電化學(xué)DNA 傳感器的組成及其在DNA 損傷研究、環(huán)境污染監(jiān)控、病原基因檢測(cè)、基因疾病診斷和藥物機(jī)理分析等方面的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié),并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了評(píng)述。關(guān)鍵詞電化學(xué)脫氧核糖核酸傳感器,脫氧核糖核酸,評(píng)述2001212229收稿;2002206206接受本文系國家自然科學(xué)基金資助課題(N o.299750131引言隨著人類基因工程的迅速發(fā)展,傳統(tǒng)的生化方法已不能滿足需要,許多新的分析方法和檢測(cè)器件應(yīng)運(yùn)而生,DNA 傳感器便是其中之一。DNA 傳感器的基本原理是檢測(cè)由DNA 探針?biāo)?/p>

2、供的分子識(shí)別過程,并通過一個(gè)換能器將檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)化為可識(shí)別信號(hào)。DNA 傳感器種類很多,按換能方法分類,主要有光纖熒光法1,2、假布儒斯特角反射法3、表面等離子共振法4、壓電共振法5,6、石英晶體微天平法7,8、表面聲波法9,10、化學(xué)發(fā)光法11,12、電位滴定法13,14、阻抗譜法15,16、電容法17和伏安法1822等。其中,基于電化學(xué)換能方法的DNA 傳感器因其體積小、花費(fèi)低和易微型化等特點(diǎn)而備受人們青睞。有關(guān)DNA傳感器的評(píng)論文章近年來已有報(bào)道2326。1997年翟俊輝等23和朱濱等24曾對(duì)DNA 傳感器作過總結(jié),龐代文等25和彭圖治等26也分別對(duì)電化學(xué)DNA 傳感器的基本結(jié)構(gòu)和性能作了

3、評(píng)述。本文著重對(duì)電化學(xué)DNA 傳感器的原理和應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。2DNA 電化學(xué)傳感器的原理電化學(xué)DNA 傳感器一般由一個(gè)固定DNA 片段的電極和用于檢測(cè)的電活性雜交指示劑構(gòu)成25。在適當(dāng)條件下,利用兩條互補(bǔ)的DNA 單鏈間的特異性相互作用,使電極表面上已知序列的DNA 片段(DNA 探針與溶液中的待測(cè)序列DNA (靶序列發(fā)生雜交,通過雜交前后電活性指示劑的電化學(xué)響應(yīng)的變化進(jìn)行測(cè)定;或使電極表面的靶序列與溶液中的已標(biāo)記電化學(xué)活性物質(zhì)的DNA 探針雜交27來測(cè)定靶序列。在電極表面的DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)形成后,該傳感器還可用于檢測(cè)那些與DNA 雙鏈有著特殊親和力的電活性小分子。2.1基底電極有關(guān)核

4、酸的電化學(xué)研究早在40多年前就已見報(bào)道28,29,當(dāng)時(shí)所使用的電極是滴汞電極。70年代,懸汞電極30,31和碳電極32的使用使DNA 的電化學(xué)研究得以深入。80年代末,Pale ek 等利用核酸修飾汞電極,將核酸伏安分析的靈敏度提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)3337。核酸修飾汞電極主要利用DNA 在汞表面的吸附進(jìn)行痕量RNA 、超螺旋DNA 及DNA 損傷的檢測(cè)38。由于疏水性堿基與汞電極疏水性表面之間強(qiáng)烈的相互作用,導(dǎo)致電極表面的DNA 探針無法與靶序列雜交39,限制了汞電極在核酸分析中的應(yīng)用。為了解決這個(gè)問題,人們將目光轉(zhuǎn)向固體電極。常用于這一領(lǐng)域的電極為金電極和碳電極。Millan 等在1993年就已

5、利用玻碳電極獲得了具有序列選擇性的電化學(xué)DNA 傳感器22;隨后,Hashim oto 等發(fā)展了一種基于金電極的基因檢測(cè)傳感器18。其它碳材料如石墨電極40、碳糊電極41和石墨印刷電極42等也分別被用于DNA 傳感器的研制。近年來,將Pt 電極用作電化學(xué)DNA 傳感器的研究也見報(bào)道43,Napier 等則利用尼龍和硝化纖維聚合物修飾的錫摻雜的銦氧化物電極來測(cè)定DNA 上鳥嘌呤的電催化氧化44。第31卷2003年1月分析化學(xué)(FE NXI H UAX UE 評(píng)述與進(jìn)展Chinese Journal of Analytical Chemistry 第1期1101152.2DNA 探針及其固定目前所

6、使用的DNA 探針大多為人工合成的短鏈DNA ,其長(zhǎng)度從十幾個(gè)堿基到上千個(gè)堿基不等,一般是使用已被公認(rèn)的可識(shí)別出靶序列所需的最短序列。天然DNA 用作探針的應(yīng)用則較少,龐代文等曾對(duì)天然小牛胸腺DNA 在玻碳電極、鉑電極和金電極上的固定及修飾電極的性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究4549。DNA 探針在電極上的固定是電化學(xué)DNA 傳感器制備中的關(guān)鍵步驟,Palanti 等曾對(duì)固定化方法進(jìn)行過總結(jié)50,如吸附法、生物素2親和素法及共價(jià)鍵合法等。在這些修飾方法中吸附法是最簡(jiǎn)單的,一般是直接將DNA 溶液滴涂在裸電極上46,或者將電極浸入DNA 溶液中在一定電壓下富集5152。但是,吸附法固定的DNA 在雜交過程

7、中可能脫附,且該方法易扭曲DNA 的結(jié)構(gòu),造成固定DNA 的無法接近和不正確雜交,因而吸附法并沒有成為DNA 雜交傳感器制備的主要方法。Fang 等曾利用生物素2親和素之間特殊的相互作用將生物素標(biāo)記單鏈DNA 分子固定到修飾有親和素的固體表面53;K rull 等將單鏈DNA 的端基衍生上C 16烷基,然后通過LB 膜技術(shù)固定DNA 探針5456;而G arnier 等則利用吡咯的電聚合進(jìn)行DNA 探針的固定57。目前,共價(jià)鍵合法已普遍用于DNA 雜交傳感器的研制。根據(jù)不同的電極表面,可采用不同的鍵合方法。對(duì)于玻碳電極,一般可先將電極表面氧化生成羧基,再在水溶性碳二亞胺(E DC 、N 2烷基

8、磺基琥珀酰亞胺(NHS 等偶聯(lián)活化劑的幫助下將單鏈DNA 固定于電極表面22。碳電極的表面氧化則有多種方法,如高錳酸鉀濕法氧化、氧等離子體處理或電化學(xué)氧化處理等。對(duì)于碳糊電極,可在碳粉中預(yù)先摻入一些添加物,如十八烷基胺或十八烷基酸21等,再通過添加物上的官能團(tuán)鍵合DNA 。DNA 在金電極上的固定主要是利用Au 2S 鍵,一種方法是將DNA 鏈端巰基化18,58,59,另一種方法是在金電極表面形成具有特殊官能團(tuán)的巰基自組裝單層,再共價(jià)鍵合DNA 分子45,48,60。龐代文等曾將巰基乙醇、半胱胺和巰基丙酸3種具有不同官能團(tuán)的硫化物自組裝單層用于DNA 的固定,指出巰基乙醇修飾單層是3者中效果最

9、好的DNA 固定基底48。2.3電活性指示劑根據(jù)與固定DNA 之間的關(guān)系,電活性雜交指示劑可分為內(nèi)部和外部指示劑兩類。所謂內(nèi)部電活性指示劑是利用DNA 分子中堿基或其它修飾基團(tuán)的電活性進(jìn)行檢測(cè)。眾所周知,雖然DNA 鏈的脫氧核糖和磷酸骨架均是電化學(xué)非活性,但是鳥嘌呤和腺嘌呤的氧化電位卻在碳電極的電化學(xué)窗口之內(nèi)61。Wang 等用肌苷代替DNA 探針中的鳥嘌呤來消除探針中鳥嘌呤的氧化峰,然后利用探針與靶序列雜交后出現(xiàn)的鳥嘌呤的氧化峰進(jìn)行檢測(cè)62。方禹之等在靶序列DNA 的末端衍生二茂鐵基團(tuán),通過檢測(cè)二茂鐵電化學(xué)信號(hào)的有無來表征雜交事件的發(fā)生與否63。Lumley 2W oodear 等則在待測(cè)D

10、NA 鏈端衍生辣根過氧化酶,一旦進(jìn)行雜交反應(yīng),修飾電極便能催化過氧化氫的電化學(xué)還原64。另一種內(nèi)部指示劑法是三明治法,它先將待測(cè)的長(zhǎng)鏈DNA 與固定化的短鏈探針雜交,然后再讓長(zhǎng)鏈上未雜交部分與修飾有電活性標(biāo)記物的短鏈DNA 雜交,從而進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)65。內(nèi)部指示劑在靈敏度和選擇性上有一定的優(yōu)勢(shì),但其探針的合成步驟較繁瑣,因而目前在電化學(xué)DNA 傳感器領(lǐng)域占主導(dǎo)地位的仍然是外部指示劑法。外部指示劑是指那些能與DNA 單、雙鏈以不同作用方式結(jié)合的電活性小分子,大致可分為兩類:一類是過渡金屬的絡(luò)合物,主要有Pt 、Ru 、C o 、Fe 和Os 等金屬的絡(luò)合物6671;另一類為雜環(huán)有機(jī)化合物,如乙錠

11、、蒽類、吩噻嗪、吖啶及苯甲基紫羅堿等7276。Pyle 等曾對(duì)指示劑與DNA 結(jié)合的不同影響因素進(jìn)行過研究,如幾何形狀、分子大小、疏水性和形成氫鍵的能力等,他們認(rèn)為分子幾何形狀的影響最為重要68。Hashim oto 等在比較眾多電活性指示劑在熱解石墨電極上的伏安性質(zhì)之后,指出道諾霉素有合適的氧化還原電位,較高的電流密度且對(duì)單、雙鏈DNA 有不同的響應(yīng)電位,所以是一種最理想的DNA 雜交指示劑19。Aslanoglu 等重點(diǎn)研究了金屬絡(luò)合物的離子電荷、幾何形狀和配體對(duì)鍵合常數(shù)與鍵合位點(diǎn)數(shù)的影響,同時(shí)指出微電極在研究金屬絡(luò)合物與DNA 相互作用方面有著常規(guī)電極無可比擬的優(yōu)勢(shì)77。3電化學(xué)DNA

12、傳感器的應(yīng)用核酸是已被廣泛應(yīng)用的分子識(shí)別工具78,基于核酸識(shí)別的電化學(xué)DNA 傳感器的應(yīng)用已涉及環(huán)境、醫(yī)藥、食品等諸多領(lǐng)域。大致包括DNA 損傷研究、環(huán)境污染監(jiān)控、病原基因檢測(cè)、基因疾病診斷、藥物機(jī)111第1期陸曉軍等:脫氧核糖核酸電化學(xué)傳感器的原理及其應(yīng)用理分析等幾個(gè)方面。3.1DNA損傷研究DNA損傷是指由于化學(xué)物質(zhì)的作用或受輻射而引起的DNA磷酸核糖骨架的斷裂,磷酸、核糖或堿基的損傷等。DNA損傷種類繁多,僅氧化損傷一類,目前已證實(shí)的就有100多種79。由于DNA損傷會(huì)極大地?cái)_亂生物體正常的生理活動(dòng),所以,很久以來就是生化研究的一個(gè)重點(diǎn)。Palecek等曾在1996年80和1998年81

13、兩次對(duì)用于DNA損傷研究的DNA傳感器進(jìn)行了綜述,并認(rèn)為基于汞電極的傳感器最適合于DNA損傷的研究。2000年,他們又用懸汞電極發(fā)展了一種新的DNA傳感器用于監(jiān)控由Fenton 反應(yīng)所造成的DNA鏈的斷裂82。3.2環(huán)境污染監(jiān)控眾所周知,許多環(huán)境污染物的毒性就表現(xiàn)在它們與DNA間的相互作用,因此,DNA傳感器可被用于環(huán)境中污染物的監(jiān)控。Wang等在1997年曾對(duì)這一方面的發(fā)展進(jìn)行了綜述83,提出了3種檢測(cè)方案:利用固定的雙鏈DNA修飾層使電活性污染物在電極上優(yōu)先富集;檢測(cè)由污染物鍵合引起的電極表面修飾核酸內(nèi)在氧化信號(hào)的改變;對(duì)于非電活性的分析物,可通過它與一電活性物質(zhì)在DNA修飾電極表面的結(jié)合

14、競(jìng)爭(zhēng)來進(jìn)行測(cè)定。其后,K rull等又利用基于雙層類脂膜(BLMs的電化學(xué)DNA傳感器來檢測(cè)環(huán)境中黃曲霉素M154和肼類物質(zhì)55,其中黃曲霉素M1的檢測(cè)限達(dá)到0.5mm olL,而肼類物質(zhì)的檢測(cè)限更達(dá)到gL級(jí)。3.3病原基因檢測(cè)人類的許多傳染性疾病是由環(huán)境中的病毒、病菌或寄生蟲引起的,所以,病原基因的測(cè)定也是電化學(xué)DNA傳感器的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。例如,在發(fā)展中國家每天約有11000名兒童死于由隱孢子蟲引起的腹瀉,Wang等利用一段38個(gè)堿基的低聚核苷酸探針制備了一種隱孢子蟲DNA傳感器,通過計(jì)時(shí)電位溶出法檢測(cè),檢測(cè)限可達(dá)到ng級(jí)84。同樣的方法也可被用于檢測(cè)大腸桿菌85、愛滋病毒86和結(jié)核桿菌

15、87等。Ozs oz等研制出一種乙肝病毒DNA傳感器,用示差脈沖伏安法驗(yàn)證了該傳感器對(duì)特定序列DNA片斷的選擇性88。Azek等制備了巨細(xì)胞病毒的基因傳感器,其檢測(cè)結(jié)果比凝膠電泳靈敏23000倍,比比色雜交試驗(yàn)靈敏83倍89。Ivnitski等對(duì)用于食品工業(yè)中病原細(xì)菌檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的原理和應(yīng)用作了總結(jié),并對(duì)該方面未來的發(fā)展進(jìn)行了展望90。3.4基因疾病診斷現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究成果表明,許多疾病,如癌癥和遺傳病等的發(fā)生都與基因的突變有關(guān)。Hashim oto 等將一段20個(gè)堿基的探針固定于金電極,制備了一種用于致癌基因v2myc序列檢測(cè)的電化學(xué)傳感器,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其效果很好18。Wang等通過一段

16、固定在傳感器上的17個(gè)堿基的肽核酸PNA探針完成了抑癌基因P55的點(diǎn)突變檢測(cè)91。Bardea等在金電極上組裝了一個(gè)3組分的低聚核苷酸修飾層,通過法拉第阻抗譜法發(fā)展了一種家族蒙性白癡癥的特效生化傳感器16。3.5藥物機(jī)理分析許多藥物是通過與DNA的結(jié)合而起作用的,因而電化學(xué)DNA傳感器是這些藥物與DNA作用機(jī)理研究的有力工具。Maeda等用DNA修飾電極研究了抗瘧藥阿的平與DNA分子之間的強(qiáng)烈作用92。Brett等利用DNA傳感器研究了硝基咪唑類藥物的電化學(xué)還原,與普通玻碳電極相比,DNA傳感器能預(yù)富集藥物,因而可達(dá)到更低的檢測(cè)限93。該課題組還用DNA傳感器進(jìn)行了血清樣品中抗癌藥物Carbo

17、platin的電化學(xué)測(cè)定,檢測(cè)限為5.710-6m olL94。Brabec等將修飾了質(zhì)粒體DNA的石墨電極作為抗癌藥物鉑類化合物的傳感器,用于該類藥物檢測(cè)的速度快、檢測(cè)限低95。4結(jié)語作為一種新型生物傳感器,電化學(xué)DNA傳感器不僅具有DNA雜交反應(yīng)高度的特異性和可逆性,又具有電化學(xué)傳感器易于微型化等傳統(tǒng)特點(diǎn),已成為當(dāng)今生物傳感器研究的熱門,是DNA分析的重要工具。但是,迄今為止,這一領(lǐng)域的工作基本停留在實(shí)驗(yàn)室階段,真正商品化的產(chǎn)品還不多。困擾其發(fā)展的主要問題在于相對(duì)低的靈敏度和穩(wěn)定性。為了解決靈敏度問題,人們開始引入一些DNA擴(kuò)增方法。211分析化學(xué)第31卷如Marrazza 等將電化學(xué)DN

18、A 傳感器和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR 結(jié)合在一起,實(shí)現(xiàn)了載脂蛋白E (apoE 的不同基因型的快速區(qū)分96?？梢灶A(yù)計(jì),隨著研究的不斷深入,高靈敏度的電化學(xué)DNA 傳感器將得到快速發(fā)展,以適應(yīng)生命科學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域的需要。R eferences1G raham C R ,Leslie D ,Squirrel D J.Biosens .Bioelectron .,1992,7(7:4874932Piunno P E A ,K rull U J ,Huds on R H E ,Damha M J ,C ohen H.Anal .Chim .Acta ,1994,288:2052143Mandeniu

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