結締組織生長因子對視網膜色素上皮細胞增生和黏附的調節(jié)作用(一)

1、結締組織生長因子對視網膜色素上皮細胞增生和黏附的調節(jié)作用(一)    作者：郭長梅，惠延年，王雨生，田艷明，王靜波，馬吉獻【摘要】 目的 觀察重組人結締組織生長因子(rhCTGF)對視網膜色素上皮(RPE)細胞增生和黏附的影響。方法 用CTGF蛋白、多聚賴氨酸(PLL)和膠原分別包被培養(yǎng)板，觀察CTGF促進RPE細胞黏附的作用；用四唑鹽(MTT)比色試驗和流式細胞儀(FCM)測定RPE細胞增生反應。結果 10-30mg/L的CTGF蛋白提高RPE細胞的貼壁黏附能力，與未包被的對照組相比，差異有統計學意義(P0.05)；30mg/L CTGF促進RPE細胞

2、黏附的能力與0.1g/L膠原的作用一致，但略低于0.1g/L PLL的作用。MTT實驗顯示CTGF刺激RPE細胞生長，CTGF作用24h刺激RPE細胞增生的能力最強。FCM測定細胞周期結果顯示S期百分比隨著CTGF濃度增加而逐漸增加，無血清培養(yǎng)的對照組S期百分比為(7.5±0.4)%，60g/LCTGF刺激24h后，S期百分比上升至(16.1±2.0)%。結論 CTGF可以促進RPE細胞的黏附和增生，在增生性玻璃體視網膜病變等眼內增生性疾病中可能有重要意義。 【關鍵詞】 結締組織生長因子；視網膜色素上皮細胞；細胞黏附；細胞增生增生性玻璃體視網膜病變(proliferativ

3、e vitreoretinopathy, PVR)是孔源性視網膜脫離及其視網膜復位手術后的嚴重并發(fā)癥，視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)細胞是其主要的增生細胞1。RPE細胞在炎性因子等刺激下游離移行，離開原位后附著在玻璃體纖維、視網膜表面和細胞外基質(extracellular matrix, ECM)上，才能獲得異常增生分化的能力。RPE細胞的黏附和異常增生，是PVR病理過程的重要環(huán)節(jié),也是目前研究的一個熱點。結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)是近幾年發(fā)現的一個新的分泌型生長因子，分子質

4、量為38ku、富含半胱氨酸的分泌蛋白，屬于近年發(fā)現的一個新的即刻早期基因家族CCN 家族的成員，具有多種生物學功能，包括參與調節(jié)多種細胞的生長及ECM的產生，在細胞分化和組織創(chuàng)傷愈合等生物學過程有重要意義23。在本研究中，我們的目的是觀察重組人CTGF(rhCTGF)對RPE細胞增生和黏附功能的影響，為防治PVR提供一個新思路。1 材料與方法1.1 主要試劑rhCTGF(32mg/L)由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所病毒免疫室李琦涵教授惠贈；多聚賴氨酸(polyLlysine, PLL)、膠原、小牛血清白蛋白(BSA)、四唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司；DNAPrep Reagent S

5、ystem 試劑盒購自美國Coulter公司。1.2 人RPE細胞培養(yǎng)與鑒定從意外死亡的健康成年男性獲取供體眼球，于死亡后24h內分離培養(yǎng)RPE細胞，具體方法參考王雨生等報道的方法4。傳代細胞用含10%(體積分數)小牛血清的Dulbecco改良Eagle 培養(yǎng)基和Hams F12(DMEM/F12)的混合完全培養(yǎng)基(青霉素100u/mL，鏈霉素100u/mL)，置于37、5%(體積分數)CO2孵箱中培養(yǎng)；用抗人角蛋白抗體免疫細胞化學染色進行細胞鑒定。取第4-7代細胞用于實驗。1.3 RPE細胞黏附試驗1.3.1 包被培養(yǎng)板將純化的rhCTGF用0.01mol/L PBS配成 5、10、20、3

6、0mg/L 4種不同質量濃度。將4種不同質量濃度rhCTGF、PLL(0.1g/L)、膠原(0.1g/L)分別加入96孔板中，每孔50L，4下孵育16h；10g/L BSA 室溫下孵育1h，封閉未飽和的蛋白結合位點，無菌PBS沖洗每孔2遍，在超凈臺中吹干。未包被的培養(yǎng)板作為對照。1.3.2 黏附試驗消化收集近鋪滿期的RPE細胞，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞2次(1000r/min，離心5min)，以2.5×105/mL細胞密度重懸于含10g/L BSA的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，每孔50L細胞懸液接種于包被好的96孔板中，置于37培養(yǎng)箱中讓細胞貼壁。60min后將培養(yǎng)板取出，無菌PB

7、S洗滌每孔2遍以洗去未貼壁細胞。每孔加入含MTT溶液(5g/L，20L)的新鮮培養(yǎng)液150L。繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150L DMSO，充分振蕩10min，在酶聯免疫檢測儀上在490nm波長測定各孔吸光度值(absorbance，A值)。每個濃度設8個重復孔，試驗重復3次。1.4 CTGF對RPE細胞促增生作用1.4.1 實驗分組 無血清對照組； 無血清培養(yǎng)液+rhCTGF組：設4種質量濃度，分別為5、15、30和60g/L。1.4.2 MTT比色試驗2.5g/L胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的RPE細胞，用含10%(體積分數)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液制成單個細胞懸液，調整RPE細胞密度為

8、1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100L。置于37 CO2孵箱中培養(yǎng)24h，換用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液使細胞靜止24h。按實驗分組，再分別加入含不同濃度rhCTGF的新鮮無血清培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36和48h。在不同培養(yǎng)時間點，每孔加入MTT溶液(5g/L)20L，37繼續(xù)孵育4h，中止培養(yǎng)，棄孔內上清液。每孔加入150LDMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上在490nm波長測定各孔A值，計算細胞生長促進率。設不接種細胞的空白調零孔。每組實驗設8個重復孔，實驗重復3次。生長促進率(實驗組A值-對照組A值)÷對照組A值

9、15;100%1.5 流式細胞術(FCM)測定細胞增生周期近鋪滿期RPE細胞消化后，以1×104/mL的細胞密度等量接種于5個25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 CO2孵箱中培養(yǎng)24h，換用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液使細胞靜止24h。按實驗分組，再分別加入含不同質量濃度rhCTGF的新鮮無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，2.5g/L胰酶消化收集細胞，PBS洗滌細胞2次，加入1mL PBS將細胞混勻，再加入2mL無水乙醇立即振蕩混勻，用封口膜封口，置于4冰箱固定24h后送檢。檢測前用PBS洗滌細胞2次，調整細胞密度為1×106/mL，取100L樣品，加入DNAPrep sta

10、in染料500L在室溫中避光染色15min，上機檢測。FCM檢測時所用激光波長為488nm，發(fā)射波長為525nm，激光功率為260mW。每份樣本均檢測5500個細胞，用DNA MultiCycle 軟件進行統計擬合分析。實驗重復3次。1.6 統計學處理試驗數據均用±s表示，采用SPSS 10.0 統計軟件行t檢驗分析兩組間差異，顯著性水準設為0.05。2 結 果2.1 人RPE細胞培養(yǎng)與鑒定第3代人RPE細胞經免疫細胞化學法行抗人細胞角蛋白(CK)染色，可見細胞漿呈棕黃色著色，表現為CK免疫反應陽性，陽性率為100%。2.2 CTGF對RPE細胞黏附的影響為了排除其他血清蛋白以及細胞

11、增生對試驗結果的影響，我們采用含10g/L BSA的無血清培養(yǎng)液，RPE細胞在無血清培養(yǎng)液中的貼壁能力較弱。10-30mg/L的CTGF蛋白和PLL(0.1g/L)、膠原(0.1g/L)包被培養(yǎng)板，均可以提高RPE細胞的貼壁黏附能力，與未包被的對照組相比，差異有統計學意義(P0.05)。并且CTGF介導RPE細胞黏附呈劑量依賴性。30mg/L CTGF促進RPE細胞黏附的能力與0.1g/L膠原的作用一致，但略低于0.1g/L 的PLL(圖1)。2.3 CTGF對RPE細胞增生的影響2.3.1 MTT比色實驗無血清DMEM/F12靜止的RPE細胞，加入不同濃度rhCTGF作用12、24、36和4

12、8h后，MTT法測定反映細胞數的A值，結果見表1。15-60g/L CTGF均可以刺激RPE細胞生長,呈劑量依賴性，與對照組相比差異有統計學意義 (P0.05)。5g/L CTGF在24h的A值與對照組間差異有統計學意義(P0.05)，其余各時間點的差異無統計學意義。從圖2可見，CTGF作用24h刺激RPE細胞增生的能力最強。表1 MTT法檢測rhCTGF對RPE細胞增生的影響（略）2.3.2 FCM測定細胞周期rhCTGF處理無血清培養(yǎng)的RPE細胞24h后，FCM檢測細胞周期各期的數值見表2，DNA波形圖見圖3。經統計學檢驗，RPE細胞的S期百分比隨著CTGF濃度增加而逐漸增加，15-60g

13、/L CTGF組與對照組比較差異具有統計學意義(P0.05)。表2 rhCTGF處理RPE細胞后細胞周期的變化（略）3 討論CTGF對多種細胞的生長具有調節(jié)作用，在體外能誘導多種細胞增生，如CTGF可刺激正常大鼠腎成纖維細胞 (NRK)增生，刺激DNA合成5。Shimo 等6研究發(fā)現用CTGF反義寡核苷酸或反義RNA阻斷內源性CTGF的表達，也可以抑制血管內皮細胞的增生。CTGF通過調控周期蛋白依賴性激酶p27Kipl引起pRb超磷酸化，釋放E2F，調控cyclin A基因的轉錄，升高cyclin A水平，使細胞從G1晚期進入S期，從而調節(jié)TGF的促有絲分裂活性；在成纖維細胞中還可持續(xù)活化p4

14、2/p44 MAPKs，促進細胞增殖5。CTGF具有ECM相關的信號蛋白屬性，既是肝素結合型ECM相關蛋白，又與Von Willegrand因子、血小板反應蛋白等其他ECM相關信號蛋白有類似序列，可以和細胞膜上的超家族受體整合素結合2,7。整合素在正常情況下是無活性的，一旦在激素、細胞因子、ECM或其他細胞的刺激下，其構型和親和力發(fā)生改變，可以與局部黏附的激酶結合產生作用，激活MAPK p42/44 和Rac，引起細胞內一系列生化改變。CTGF即通過此信號傳導機制來調節(jié)細胞的生物學功能，如Fisp12(鼠源性CTGF)通過v3整合素依賴途徑促進血管內皮細胞的黏附、存活8。近來還發(fā)現CTGF經整

15、合素61和細胞表面乙酰肝素硫酸酯蛋白聚糖(HSPGs)介導與成纖維細胞的黏附9。CTGF在較高質量濃度(mg/L)時同樣促進上皮細胞的黏附10，與我們的實驗結果一致?？自葱砸暰W膜脫離發(fā)生時，刺激RPE細胞重新進入細胞周期和活力增加的原因目前尚不清楚，但似乎與RPE細胞間的接觸喪失以及對某些生長因子的敏感性增強有關11。RPE細胞開始移行、黏附、異常增生并分泌膠原等ECM，以此來修復缺損區(qū)。Hinton等11用免疫組化方法證實PVR增生膜的實質細胞和細胞外基質中存在CTGF高表達。Meyer等12從基因水平證實增生性視網膜疾病的纖維血管膜中轉化的RPE細胞和成纖維細胞樣細胞表達CTGFmRNA，

16、并且與型膠原和細胞黏合素的表達有一致性。我們以前的研究也顯示PVR增生膜上高表達CTGFmRNA13。本實驗采用MTT法和FCM發(fā)現CTGF可以劑量依賴性地刺激無血清培養(yǎng)的RPE細胞增生；10-30mg/L的CTGF蛋白可以提高RPE細胞的貼壁能力，介導RPE細胞黏附呈劑量依賴性，30mg/L CTGF促進RPE細胞黏附的能力與0.1g/L膠原的作用一致，但略低于0.1g/L PLL的作用。以上研究結果提示CTGF可以促進RPE細胞的黏附和增生，在PVR等眼內增生性疾病中可能有重要意義。致謝：本研究得到德國洪堡基金會(Alexander von Humboldt Foundation)儀器設備

17、捐贈基金(V8151/02085)資助?！緟⒖嘉墨I】1惠延年. 玻璃體病 M/惠延年. 眼科學. 第六版. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2004:162168.2Moussad EE, Brigstock DR. Connective tissue growth factor: what's in a name J? Mol Genet Metab, 2000, 71(12):276292.3Blom IE, Goldschmeding R, Leask A. Gene regulation of connective tissue growth factor: new targets for antifibrotic therapy J? Matrix Biol, 2002, 21(6):473482.4王雨生，嚴密. 可見光對原代培養(yǎng)人視網膜色素上皮細胞的光化學損傷 J. 中華眼底病雜志，1996, 12(3):174176.5Kothapalli D, Grotendorst GR. CTGF modulates cell cycle pr