電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展

1、電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展張軍瑞1,2 陳健*1 劉仲明21(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣州510640 2(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科,廣州510010摘 要 本文介紹了電化學(xué)發(fā)光的發(fā)展?fàn)顩r和最新研究方向,綜述了近年來電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)的應(yīng)用和研究進(jìn)展,并展望了電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)的發(fā)展前景。關(guān)鍵詞 電化學(xué)發(fā)光免疫檢測;抗原;抗體;綜述2009 12 17收稿;2010 03 12接受本文系國家科技支撐計(jì)劃(N o .2006BAD27B04資助*E m ai:l fejc h en scu t .edu .cn 1 引 言免疫檢測法具有快速、靈敏、選擇性好等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于

2、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域16。近年來,隨著對免疫傳感器的深入研究,發(fā)展了多種檢測技術(shù),包括電化學(xué)、光學(xué)、壓電檢測、放射免疫分析法和電化學(xué)發(fā)光檢測法等712。其中較常用的放射免疫分析法涉及環(huán)境污染問題,酶免疫分析法受到酶保存和檢測靈敏度的限制;時間分辨熒光免疫法有光的散射和雜光的干擾等問題,限制了其在免疫方面的應(yīng)用。電化學(xué)發(fā)光是一種由于電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。1960年,研究者初次詳細(xì)報(bào)道了紅熒烯和類緣化合物電化學(xué)發(fā)光1315,近年來也發(fā)表了多篇關(guān)于電化學(xué)發(fā)光的綜述1625。電化學(xué)發(fā)光因檢測范圍寬、靈敏度高、信號干擾低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)已在免疫檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用2630。2

3、 電化學(xué)發(fā)光免疫檢測的研究2.1 魯米諾及其衍生物做標(biāo)記2.1.1 魯米諾及其衍生物電化學(xué)發(fā)光的研究 魯米諾在一定條件下可被一些氧化劑氧化,發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng),輻射出最大發(fā)射波長為425n m 的化學(xué)發(fā)光。魯米諾的衍生物主要有異魯米諾、4 氨基已基 N 乙基異魯米諾、N (4 氨基已基 N 乙基異魯米諾(AHE I和N (4 氨基丁基 N 乙基異魯米諾(ABE I等。雖然目前對于魯米諾電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理尚未形成統(tǒng)一的認(rèn)識,但魯米諾及其衍生物是電化學(xué)發(fā)光最常用的發(fā)光標(biāo)記物質(zhì)之一,已得到廣泛研究31。Yang 等32研究了ABE I 在+1.0V (Ag /AgC l氧化電位的堿性溶液中可以發(fā)光,加

4、入H 2O 2可以顯著增強(qiáng)其化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度,溶液的p H 值、H 2O 2的濃度和工作電位都對電化學(xué)發(fā)光的響應(yīng)度產(chǎn)生影響。在最佳條件下,ABE I 的檢測范圍為1.3 10-66.5 10-12m o l/L ,在信噪比(S /N 為3時,ABE I 的檢出限為2.2 10-12m o l/L 。最近,Chu 等33研究了中性溶液中反應(yīng)氧對魯米諾電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響,結(jié)果顯示,反應(yīng)氧無論是溶解于溶液中還是固定在常規(guī)的電極表面,都可以顯著增強(qiáng)魯米諾的化學(xué)發(fā)光信號。近年來,人們通過各種方法提高電化學(xué)發(fā)光的檢測靈敏度,包括使用新的或多種標(biāo)記物34,35、探索新的電極材料3639。Dong 等38的研

5、究結(jié)果表明,在中性溶液中,魯米諾在納米金修飾的電極上可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光。發(fā)光強(qiáng)度不僅和納米金有關(guān),還受電極的影響,金電極和玻璃碳電極是比較好的電極,而且納米金修飾的金電極和玻璃碳電極還具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性,并且不需要對電極做預(yù)處理。電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度還受納米金顆粒大小的影響,用直徑為16nm 的納米金修飾電極可以產(chǎn)生較強(qiáng)烈的電化學(xué)發(fā)光。W ang 等39用銀納米修飾金電極,將其作為工作電極,研究了魯米諾在中性和堿性溶液中的電化學(xué)發(fā)光,結(jié)果表明,無論在中性還是堿性溶液中,魯米諾在銀納米修飾的金電極上都可以產(chǎn)生很強(qiáng)烈的發(fā)光,并且重復(fù)性良好。2.1.2 魯米諾及其衍生物做標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測

6、 早期,Tanaka 等40依據(jù)結(jié)合的抗原可以抑第38卷2010年8月 分析化學(xué)(FENX IHUAXUE 評述與進(jìn)展Ch i nese Journa l o f Ana l y ti ca l Chem istry 第8期12191226制魯米諾電化學(xué)發(fā)光的原理建立了一種電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢測人免疫球蛋白(hIg G 。首先將魯米諾標(biāo)記在抗體上,當(dāng)加入抗原時,抗原與抗體結(jié)合,抑制其化學(xué)發(fā)光,加入的抗原的濃度和電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度減弱的程度相一致,據(jù)此可以得知加入抗原的量。此方法的檢測范圍是10-1210-8g /mL 。但該方法的免疫反應(yīng)達(dá)到平衡的時間較長(數(shù)小時。此后他們又改進(jìn)了方法,即優(yōu)化

7、免疫反應(yīng)的條件,利用同樣的原理檢測了血清中的腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP41,檢出限為10-8g /L,抗原 抗體的結(jié)合時間縮短到5m in 。由于標(biāo)記后的魯米諾其發(fā)光效率明顯降低,研究者對適用于作標(biāo)記的魯米諾衍生物進(jìn)行了研究。莊惠生等42用自制的異硫氰酸異魯米諾(I TC I標(biāo)記AFP 抗體,包被板上進(jìn)行雙抗夾心免疫反應(yīng),形成免疫復(fù)合物,在電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)介質(zhì)KOH KC l H 2O 2中檢測發(fā)光信號,測定AFP 的線性范圍為5.0100.0 g /L ,檢出限為2.0 g /L ,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.2%。此方法與放射免疫法相比,相關(guān)性良好。ABE I 是異魯米諾的一種衍生物,是比較好的電化學(xué)

8、發(fā)光標(biāo)記物。A rail 等43報(bào)道了檢測h I gG 的靈敏方法,以ABE I 標(biāo)記h I gG 抗體,h I gG 和ABE I hIg G 抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)形成剛硬結(jié)構(gòu),可以顯著增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度。在此基礎(chǔ)上可以檢測加入的hI gG 的濃度,檢出限為8 0ng /L(S /N =2,這種檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)超過了當(dāng)時常規(guī)的檢測方法。Q i 等44用ABE I 標(biāo)記人免疫球蛋白,固定在納米金修飾的石墨電極上,然后加入抗原,因加入的抗原與其可以形成ABE I 的剛性結(jié)構(gòu),可以顯著增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度,加入的抗原的濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增加一致,其檢測線性范圍為3.0 10-111.0

9、10-9g /mL ,檢出限為1 10-18g /L(S /N =3。此研究結(jié)果表明,以納米金修飾電極的均質(zhì)免疫檢測是提高標(biāo)記物和免疫檢測靈敏度的有效方法。2009年,T i a n 等45也以納米金修飾金電極,ABE I 標(biāo)記人免疫球蛋白的第二代抗體,將羊抗人免疫球蛋白固定在納米金修飾的電極上,先加入人免疫球蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng),再加入用ABE I 標(biāo)記的第二代抗體,在金電極上形成夾心式免疫復(fù)合物,電解池中加入含有H 2O 2的碳酸鹽緩沖液進(jìn)行檢測,其檢測線性范圍為5.0100 g /L ,檢出限1 68 10-6g /L(S /N =3,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在為3.79%(60 g /L ,n =9。

10、此方法簡單并且靈敏度高,已成功應(yīng)用于血清中h I gG 的檢測。盡管此方法的檢測靈敏度低于同樣條件下均質(zhì)的免疫檢測方法43,44,但目前均質(zhì)的免疫檢測方法在臨床上的應(yīng)用還易受到其它物質(zhì)的干擾,而此方法可以通過簡單的清洗電極將干擾物質(zhì)除去,同時以納米金修飾的電極作為固相載體,顯著提高了檢測靈敏度,因此它可以成功應(yīng)用于實(shí)際血清樣品中人免疫球蛋白的檢測。2.2 聯(lián)吡啶釕及其衍生物做標(biāo)記2.2.1 聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光的研究 1966年,H ercu les 等46最早發(fā)現(xiàn)聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy 2+3的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象,在Ru (bpy 2+3溶液中加入胺,觀察到橘紅色的發(fā)光。Tokel 等47首次用電化

11、學(xué)方法使Ru(bpy2+3轉(zhuǎn)為激發(fā)態(tài),并觀察到Ru (bpy 2+3的電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。這些開創(chuàng)性的工作為Ru(bpy2+3電化學(xué)分析在分析科學(xué)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。Ru(bpy2+3及其衍生物是電化學(xué)發(fā)光應(yīng)用最為廣泛的發(fā)光物質(zhì),由于它具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高等特點(diǎn),所以被廣泛用于實(shí)際生物樣品的分析檢測48,49。目前,最常用的電化學(xué)發(fā)光體系為Ru(bpy2+3/TPr A ,其反應(yīng)機(jī)理如下:Ru(bpy2+3-e - Ru(bpy 33+TPr A-e - TPr A+ TPr A+ TPr A +H +TPr A +Ru(bpy33+ Ru(bpy2+3+Tpr A 氧化產(chǎn)物Ru(b

12、py2+3* Ru(bpy2+3+h v 近年來,人們對Ru(bpy2+3/TPr A 體系進(jìn)行了深入的研究,Chen 等50研究了TPr A + 在經(jīng)過電化學(xué)預(yù)處理的玻璃碳電極表面存在時間的長短對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響,當(dāng)電極上的氧化物促使TPr A+ 失去質(zhì)子生成自由基TPr A 時,會極大地抑制電化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度。他們認(rèn)為當(dāng)Tpr A 在電極上較快的被氧化時,其氧化產(chǎn)物TPr A+ 會更多的停留在電極表面,而TPr A + 失去質(zhì)子的產(chǎn)物TPr A 易于被電極破壞掉,從而使其不能參與電化學(xué)發(fā)光的反應(yīng),導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。最近,Jiang 等51在Ru(bpy2+3/Tpr A 體系的電解

13、質(zhì)溶液中加入嘧啶或其類似物(如喹啉。研究表明,加入嘧啶或其類似1220 分析化學(xué)第38卷物可以增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度,主要原因是嘧啶或其類似物可以吸附在金屬電極表面,抑制電極表面被氧化。以鉑電極為工作電極,電解質(zhì)溶液中加入嘧啶時,其電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度至少提高了5倍;以金電極為工作電極時,可以在低電位下產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光,并且其發(fā)光強(qiáng)度也明顯增加。盡管Ru(bpy 2+3/TPr A 共反應(yīng)體系得到廣泛應(yīng)用,但使用TPr A 有一定的缺點(diǎn)20,5254,如有毒、易揮發(fā)、氧化速度慢,并且Ru(bpy 2+3/TPr A 的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在很大程度上依賴于電極的材料。因此,人們在研究能替代TPr A 的物質(zhì)。L i

14、u等55研究了Ru(bpy2+3/DBAE (2 (二正丁氨基乙醇的電化學(xué)發(fā)光,結(jié)果表明,Ru(bpy 2+3/DB AE 體系具有明顯的優(yōu)越性,它可以彌補(bǔ)Ru(bpy2+3/Tpr A 體系存在的不足,在免疫檢測中DB AE 具有廣泛的應(yīng)用前景。Xue 等56用Ru (bpy 2+3/DBAE 體系檢測了多巴胺,其檢測線性范圍為5 10-107 10-7m o l/L ,檢出限4.0 10-11m ol/L 。Y in 等57將三級胺(如三乙烯四胺:TETA;N,N,N ,N 四甲基 1,4 丁二胺作為Ru(bpy2+3的共反應(yīng)物,研究了影響其電化學(xué)發(fā)光的因素,并得到了與傳統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光不同

15、的結(jié)論,對于Ru(bpy2+3/Tpr A 體系,由于Tpr A 溶解度較低,需在電解質(zhì)溶液中加入離子液體或表面活性劑,并用硫醇修飾電極,以提高其電化學(xué)發(fā)光的靈敏度,而對三級胺,其分子結(jié)構(gòu)影響電化學(xué)發(fā)光的靈敏度,如六次甲基四胺(HMTA 的分子結(jié)構(gòu)會抑制自由基的形成,使其發(fā)光效率較低,而含有羥基和羧基的共反應(yīng)物可以通過改變N 的去質(zhì)子化和自由基的穩(wěn)定性影響電化學(xué)發(fā)光效率,這些結(jié)論可以很好地促進(jìn)研究者尋找一種高效、穩(wěn)定、安全、大眾化的Ru(bpy 2+3共反應(yīng)物。Y i n 等58分別以3種氨基乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA 、氮三乙酸(NTA 和羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA 作為Ru(bpy2

16、+3的共反應(yīng)物,研究其電化學(xué)發(fā)光,此3種共反應(yīng)物對釕的檢出限分別為1,60和680f m ol/L 。在最佳條件下NTA 激發(fā)釕的電化學(xué)發(fā)光效率顯著高于TPA,并且與TPA 相比,NTA 毒性小、腐蝕性低、不易揮發(fā),可以得到廣泛地應(yīng)用。Chen 等59研究電極表面的疏水性對Ru(bpy2+3/三乙胺體系電化學(xué)發(fā)光的影響,結(jié)果表明,電極表面的疏水基團(tuán)越多,Ru(bpy2+3的共反應(yīng)物越易被氧化,并且在大多數(shù)情況下,電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度越高,然而疏水環(huán)境會促使胺正離子失去質(zhì)子,導(dǎo)致電化學(xué)發(fā)光效率降低。此研究對于建立高效的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測體系具有重要意義。2.2.2 Ru(bpy2+3衍生物作標(biāo)記的電化

17、學(xué)發(fā)光免疫檢測 目前,釕衍生物中最常用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物是Ru(bpy2+3,因?yàn)樗碾娀瘜W(xué)發(fā)光可在溶液中與適當(dāng)?shù)墓卜磻?yīng)物反應(yīng)而產(chǎn)生,發(fā)射強(qiáng)度高且相當(dāng)穩(wěn)定,成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。在早期,Xu 等60用Ru(bpy2+3標(biāo)記前列腺特異性抗原(PSA進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光。研究表明:發(fā)光強(qiáng)度和PSA 的濃度成正比,而與其質(zhì)量和大小成反比。當(dāng)加入PSA 抗體與其免疫反應(yīng)后,由于形成的免疫復(fù)合物使其質(zhì)量和大小增加,發(fā)光強(qiáng)度降低,據(jù)此可以得到不同類型的PSA 抗原與抗體的結(jié)合力,然后由結(jié)合力的大小可對抗原進(jìn)行篩選。M iao 等29將金電極表面自組裝成單分子層作為載體,生物素化的抗體固定在其表面,加入C 反應(yīng)蛋白

18、抗原,再加入用Ru(bpy 2+3標(biāo)記的C 反應(yīng)蛋白抗體,形成夾心式免疫復(fù)合物,組裝好的金電極作為工作電極,可直接適用于未知C 反應(yīng)蛋白樣品的測定,其線性范圍為124m g /L 。云雯等61將兔抗人I gG 固定在金電極上,加入hIg G 和用Ru(bpy2+3標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白抗體反應(yīng)2h,在自制的石英皿檢測池進(jìn)行檢測,其檢測線性范圍是0.052m g /L ,檢出限為20 g /L(3 。此方法操作簡單、耗時少、固定效率高、易于控制,不但能用于人Ig G 的檢測,還能應(yīng)用于其它抗原抗體的免疫檢測。納米材料以其獨(dú)特的性質(zhì)為開發(fā)新型的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器提供了一種新思路。由于碳納米管是與

19、適當(dāng)?shù)纳锓肿?、酶、氧化還原媒介物結(jié)合,可提高其選擇性和靈敏度,在生物傳感器的應(yīng)用研究中得到人們的重視。W ohlstadter 等62用自制的含碳納米管作為工作電極,他們將生物素化的甲胎蛋白抗體固定在自制的含碳納米管片狀物表面,加入甲胎蛋白和標(biāo)記有發(fā)光物質(zhì)的甲胎蛋白抗體,進(jìn)行免疫反應(yīng),形成免疫復(fù)合物,此方法檢測AFP 的線性范圍為0.1100nm o l/L 。該研究為定量檢測系列生物相關(guān)分析物提供了一個完整的分析體系,可用于基本研究、藥物分析、大樣本的檢測及醫(yī)學(xué)診斷等。磁微球因其獨(dú)特的性質(zhì)也在電化學(xué)發(fā)光免疫檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。如有較大的表面積,可以固定較高濃度的抗體、易于分離等。早期,

20、N a mba 等63用磁微球作為固相載體檢測了血清中的腫瘤標(biāo)志物AFP ,首先將抗體固定在磁微球上面,加入AFP 和標(biāo)記有發(fā)光物質(zhì)的AFP 抗體,形成免疫復(fù)合體,1221第8期張軍瑞等:電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展在電解池中由于磁力的作用使磁微球吸附到工作電極表面進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光,AFP 的濃度和電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度成比例。當(dāng)免疫反應(yīng)15m i n 后,檢測AFP 的靈敏度可達(dá)到5ng /L 。此方法簡單、快速、靈敏度高。Yu 等64也使用磁微球作為固相載體進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光免疫檢測生物標(biāo)志物,進(jìn)一步證明了使用磁微球進(jìn)行檢測不僅速度快,而且靈敏度高,可以在相關(guān)領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用。這些研究采用帶有磁性的

21、聚苯乙烯微粒技術(shù),構(gòu)建了免疫反應(yīng)在類似液相的均勻懸浮狀態(tài)進(jìn)行的方法和技術(shù),不僅反應(yīng)速度快,并且實(shí)現(xiàn)了游離和結(jié)合標(biāo)記物的分離。M iao 等65將Ru(bpy2+3的衍生物包被在聚苯乙烯微球體內(nèi)部,C 反應(yīng)蛋白抗體分別固定在磁微球和聚苯乙烯微球體表面,加入C 反應(yīng)蛋白,形成磁微球 抗體抗原抗體 聚苯乙烯微球體復(fù)合物。在檢測池中由于磁力的作用使磁微球吸附在工作電極上,加入含有TPA 的緩沖液進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光,線性范圍寬(10.010000 g /L。此方法的檢出限低于當(dāng)時常規(guī)檢測C 反應(yīng)蛋白的自動化儀器,但由于將發(fā)光物質(zhì)包被在聚苯乙烯微球體內(nèi)部,在檢測液中需加入有毒性的有機(jī)溶劑,使聚苯乙烯微球體溶解

22、,將發(fā)光物質(zhì)釋放出來,使其在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。Yan 等66將磁鐵固定在工作電極上,磁微球作為免疫復(fù)合物的載體吸附在工作電極表面,檢測血清中P53抗體,檢測的線性范圍0.011000 g /L ,每次定量檢測只需要50 L 的樣品,免疫反應(yīng)時間為30m in ,簡單,快速,靈敏度高,并且可重復(fù)利用。但此方法在臨床應(yīng)用中還受到限制,因它不能對血清中的其它物質(zhì)進(jìn)行檢測。H orn i n ger 等67也用磁微球作為固相載體,對血清中的TNF 抗體進(jìn)行了檢測,此方法準(zhǔn)確,精密,可重復(fù),可以作為物質(zhì)藥代動力學(xué)的研究,它也為檢測復(fù)合基質(zhì)中的生物大分子提供了一種新方法。2007年,Zhan 等30提出

23、一種新的電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法,檢測人血清中的C 反應(yīng)蛋白。將發(fā)光物質(zhì)Ru(bpy2+3注入脂質(zhì)體內(nèi)部,合成包被有發(fā)光物質(zhì)的脂質(zhì)體,C 反應(yīng)蛋白抗體分別結(jié)合在磁微球和包被有發(fā)光物質(zhì)的脂質(zhì)體表面,然后將C 反應(yīng)蛋白、磁微球、脂質(zhì)體混合,進(jìn)行免疫反應(yīng),形成磁微球 抗體抗原抗體 脂質(zhì)體免疫復(fù)合物,將復(fù)合物溶解于含有三丙胺、NaC l 和Triton X 100的緩沖溶液中,然后在電化學(xué)發(fā)光檢測池進(jìn)行檢測,其檢測線性范圍0.110m g /L 。此方法與文獻(xiàn)65相比不需要有毒的有機(jī)溶劑使發(fā)光物質(zhì)釋放出來,但其檢測靈敏度還有待提高。2008年,Fang 等68提出一個新的免疫模式對蛋白進(jìn)行定量檢測。他們

24、將玻璃碳電極親和素化,蛋白用Ru(bpy2+3標(biāo)記并生物素化,通過親和素和生物素的相互作用,將Ru(bpy2+3標(biāo)記的蛋白固定在玻璃碳電極上,組裝好的玻璃碳電極作為工作電極,在電解池中加入含有三丙胺的緩沖溶液進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光,檢測牛血清蛋白的線性范圍是0.0157.5 m o l/L 。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此方法的有效性和其適合蛋白的定量檢測,他們又對溶菌酶進(jìn)行了檢測,其線性范圍為0.0010.1g /L,檢出限為0.1m g /L 。此方法將玻璃碳電極親和素化,既有利于固定生物活性材料,又應(yīng)用了生物素親和素的放大技術(shù),方法簡單易行,可節(jié)約成本,有待進(jìn)一步的發(fā)展。2.3 其他金屬鰲合物做標(biāo)記2.3.1

25、 其他金屬鰲合物電化學(xué)發(fā)光的研究 其它金屬鰲合物,如Tb ,Eu ,C r ,Re 等,都可以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光,近年來已有很多人對它們的電化學(xué)發(fā)光進(jìn)行研究。2005年,H akansson 等69通過陰極脈沖極化研究了Tb( 鰲合物在M gO 電極和n ZnO A l/M g O 復(fù)合電極上的電化學(xué)發(fā)光。由于Tb( 鰲合物在電極上相對長的發(fā)光周期,可以用時間分辨電化學(xué)發(fā)光儀器對其進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,M g O 電極和n ZnO A l/M g O 復(fù)合電極都可以作為Tb( 鰲合物發(fā)光的一次性工作電極。Eu( 與適當(dāng)?shù)呐湮换?可以檢測到長時間的發(fā)光信號70。早期,R ichter 等71已經(jīng)對

26、Eu( 作標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光進(jìn)行了研究,其方法的主要缺點(diǎn)是不能用于純水體系中,并且即使在無水溶液中也產(chǎn)生很少的光子。2006年,Ji a ng 等72又研究了Eu( 鰲合物在水溶液中由于熱電子激發(fā)引起的時間分辨電化學(xué)發(fā)光,當(dāng)Eu ( 和2,6 N ,N 二 (羧甲基氨甲基 4 苯甲酰苯酚螯合,形成的螯合物可以產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光,但它在A l 2O 3電極上的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比較弱。當(dāng)加入S 2O 2-3時可以極大增強(qiáng)其電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度;加入1mm o l/L S 2O 2-3時,電化學(xué)發(fā)光周期為0.94m s 。此螯合物可以作為電化學(xué)發(fā)光免疫檢測的標(biāo)記物,而與2,6 N ,N 二 (羧甲基氨甲基 4

27、甲基苯酚螯合,形成的螯合物不會發(fā)光。L is 等73將Eu( 和其它物質(zhì)結(jié)合,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Eu( 與四丁胺陽離子螯合,形成的螯合物可以產(chǎn)生最強(qiáng)烈的發(fā)光信號。在螯合物溶液中加入鄰二氮雜菲,發(fā)光強(qiáng)度和周期都明顯增加。Stan i n sk i 等74以A l 2O 3為工作電極研究了1222 分析化學(xué)第38卷Tb 3+,Dy 3+,Eu 3+鰲合物在水溶液中的電化學(xué)發(fā)光。研究表明,這些鰲合物產(chǎn)生的電子輻射主要是通過它們的配位基向金屬電極的能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生。2.3.2 其它金屬鰲合物作標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測 H eli n 等75利用合成的Tb( 2,6 b isN,N b is(carboxy m e

28、thy la m ino m ethyl 4 benzoy l p heno l螯合物標(biāo)記人促甲狀腺激素的第二代抗體,通過熱氧化作用將硅片表面形成一層絕緣薄膜,其上依次加入抗體、抗原和標(biāo)記有發(fā)光物質(zhì)的第二代抗體進(jìn)行免疫反應(yīng),用此硅片作為工作電極,在時間分辨電化學(xué)發(fā)光基礎(chǔ)上檢測其發(fā)光信號。電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在很大范圍內(nèi)和促甲狀腺激素成線性關(guān)系,但檢出極限還有待降低。A la K le m e 等76等也利用熱氧化作用形成的硅電極作為一次性的工作電極,用自合成的Tb( 1的異硫氫酸衍生物Tb( 1 NCS 標(biāo)記C 反應(yīng)蛋白抗體,在硅電極上進(jìn)行的雙抗夾心免疫反應(yīng),電解池中加入含有0.1%N a N 3的

29、0.2m o l/L 硼酸(p H =7.8,H 2SO 4調(diào)節(jié)其pH 值檢測液進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測,得到的檢出限(0.3 g /L優(yōu)于商業(yè)上的檢測系統(tǒng)。Kul m a la 77和Esko la 78等都將鋁電極經(jīng)過特殊處理,表面被一層氧化薄膜包被,使其作為免疫復(fù)合物的固相載體,對人促甲狀腺激素(TS H 進(jìn)行了檢測,但由于氧化薄膜包被的鋁電極在水溶液中不穩(wěn)定,其檢測的準(zhǔn)確性尚有待提高。2.4 以量子點(diǎn)作發(fā)光物質(zhì)2.4.1 量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光研究 量子點(diǎn)是由少量原子組成的準(zhǔn)零級的納米材料。1962年,Naka mura 等79針對金屬超微顆粒費(fèi)米面附件電子能級狀態(tài)分布提出了著名的Kubo 理論。

30、1983年,Ja i n 等80在市售半導(dǎo)體微晶摻雜的光學(xué)濾波玻璃上觀察到了很高的3次非線性光學(xué)效應(yīng)和快速的光響應(yīng)。這一成果在光運(yùn)算、全光開關(guān)和光通信等方面具有廣闊的應(yīng)用前景,使得量子點(diǎn)的研究工作引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì),在磁學(xué),電學(xué),催化和化學(xué)傳感等方面具有廣闊的應(yīng)用前景81。D i n g 等82研究發(fā)現(xiàn)半導(dǎo)體納米晶體可以在一定的電位下被氧化和還原,并且通過一定的湮滅反應(yīng)可導(dǎo)致相應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光過程。將電化學(xué)發(fā)光技術(shù)和新興的納米技術(shù)結(jié)合起來,為量子點(diǎn)在分析科學(xué)和生命科學(xué)中的應(yīng)用開辟了一條新的途徑。目前,人們找到一種高效的方法,即用適宜的配位體或受體化學(xué)修

31、飾量子點(diǎn)表面,形成一種新型的納米材料,使其作為一種光傳感器檢測特殊的敏感性物質(zhì)。H an 等83將三聚氰胺氰尿酸鹽覆蓋在碲化鎘半導(dǎo)體納米晶體的頂端,用它作為一種新型的量子點(diǎn),通過電化學(xué)發(fā)光檢測水溶液中的H 2O 2,該傳感器的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與過氧化氫的線性響應(yīng)范圍為0.210 mo l/L,檢出限是0.06 m o l/L 。Jie 等84已經(jīng)證明了硫化鎘納米管的電化學(xué)發(fā)光;Shen 等85也報(bào)道了硫化鋅半導(dǎo)體納米晶體和共反應(yīng)物S 2O 2-8在堿性水溶液中的電化學(xué)發(fā)光。Lu 等86用聚酰胺 胺保護(hù)硫化鎘半導(dǎo)體納米晶體,與S 2O 2-8反應(yīng),可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的電化學(xué)發(fā)光信號,并且通過改變電壓脈沖

32、的持續(xù)時間和將掃描率提高,可以調(diào)整電化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度和穩(wěn)定性。研究已經(jīng)證明硫化鎘量子點(diǎn)/碳納米管(CNTs混合物是電化學(xué)發(fā)光檢測的一個重要前景,D i n g 等87已對此混合物的電化學(xué)發(fā)光作了報(bào)道。2.4.2 量子點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光免疫檢測 Jie 等88將硒化鎘量子點(diǎn)(CdSe QDs/納米管 殼聚糖/硫酸銨(APS結(jié)合起來,研制了一種新型的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測hIg G 。由于此體系有反應(yīng)性胺基產(chǎn)生,所以它可以作為一種有效的交聯(lián)劑連接生物大分子,如可以固定抗體。研究結(jié)果顯示,當(dāng)加入K 2S 2O 8作為共反應(yīng)物時,它可以極大增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光信號,APS 催化CdSe 量子點(diǎn)和K 2S 2O 8

33、反應(yīng)機(jī)理如下:CdSe NCs +n e -n CdSe - S 2O 2-8+RC 3H 7NH 2SO 2-4+SO 4- +RC 3H 7NH 2+ CdSe - +SO 4-CdSe *+SO 2-4CdSe *CdSe +h v此方法檢測結(jié)果和酶聯(lián)免疫分析檢測的結(jié)果有很大的相關(guān)性。隨后他們將CdSe QDs/納米金/前白蛋白抗體結(jié)合起來,提出一個無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測人前清蛋白89,此傳感器通過免疫復(fù)合物定量抑制CdSe QD s 和S 2O 2-8反應(yīng),檢出限達(dá)到 g /L 量級。Jie 等90又將巰代乙酸修飾的CdSe QD s/納米金/脂蛋白抗體結(jié)合,對低濃度的脂蛋白

34、進(jìn)行檢測,因脂蛋白和脂蛋白抗體特異性結(jié)合可以使發(fā)光強(qiáng)度降低,據(jù)此檢測脂蛋白的濃度,檢出限是0.006 g /L 。由于量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度低于常規(guī)的化1223第8期張軍瑞等:電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展1224 2+ 分析化學(xué) 91 第 38卷 學(xué)試劑, 如: 魯米諾、 ( bpy 3 。最近, Jie等 Ru 將金電極 /CdSeQDs碳納米管 /PDDA /納 米金 /h lgG 抗 體結(jié)合起來對 h lgG進(jìn)行檢測, 線性范圍 0 002 500 ng /L, 檢出限達(dá)到 0 6 g /L, 顯示了很高的靈敏度。 . . 綜上所述, 以量子點(diǎn)為基礎(chǔ)的無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測目前還處于初期

35、階段, 但量子點(diǎn)獨(dú)特的性質(zhì) 使其在免疫檢測領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景, 有待深入研究。 3 展 望 電化學(xué)發(fā)光免疫分析具有靈敏度高、 特異性強(qiáng)、 適用面廣等優(yōu)點(diǎn), 廣泛用于抗原、 抗體和半抗原的免 疫檢測。又因其線性范圍較寬, 符合臨床檢驗(yàn)的需要, 日益受到人們的青睞。電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 為臨床診斷和科學(xué)研究提供了一種超微量的非同位素免疫檢測手段, 在醫(yī)學(xué)、 食品、 環(huán)境分析等方面具 有廣闊的應(yīng)用前景。目前, 電化學(xué)發(fā)光免疫分析已取得了一些成就, 也存在一些問題, 例如, 將 Ru 配 合物作為電化學(xué)發(fā)光探針標(biāo)記在抗體 (抗原 上; 在某些體系中, 這種模式不僅對探針的電化學(xué)發(fā)光性 能有一定的

36、影響, 而且還影響抗原抗體的特異性結(jié)合。所以, 研究者在如何提高免疫診斷的敏感性和特 異性, 發(fā)展新的分析技術(shù)等方面仍在不斷探索。電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的發(fā)展趨勢在于合成新的發(fā) 光標(biāo)記物以及建立新的免疫分析方法等, 值得提及的是以納米材料為基礎(chǔ)的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù) 2+ 特別引人關(guān)注, 將 Ru( bpy 3 固定在碳納米管、 納米粒、 聚合薄膜上的化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光特性, 以量子 點(diǎn)為主體的無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù), 使其在生物醫(yī)學(xué)上的具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來, 新 的材料, 如無機(jī)金屬絡(luò)合物薄膜、 有機(jī)分子、 納米材料修飾的電極等, 也將推動電化學(xué)發(fā)光進(jìn)一步的發(fā) 展。人們通過各種

37、方法使電化學(xué)可視化, 如掃描電化學(xué)顯微鏡。另一方面, 人們通過酶促反應(yīng)提高電化 學(xué)發(fā)光檢測的速度。化學(xué)發(fā)光免疫檢測與微流技術(shù)的結(jié)合將會產(chǎn)生一種超高靈敏度的電化學(xué)發(fā)光檢檢 方法, 這些研究使電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)的應(yīng)用呈現(xiàn)美好的前景。 R eferences 1 2 Sm ithW D. A nal. Chem. , 2002 74( 17: 462A 466A , Chr istodou lides N, T ran M, F lor iano P N, R odr iguezM, G oodey A, A lM, N e ik irk D M cD ev itt J A

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