生物大分子納米孔分析技術(shù)研究進(jìn)展_圖文

1、講述與進(jìn)展DO I :10. 3724/SP. J . 1096. 2010. 00280生物大分子納米孔分析技術(shù)研究進(jìn)展丁克儉1, 2 張海燕2 胡紅剛2 趙紅敏2 關(guān)偉軍*1 馬月輝*11(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所, 北京100193 2(北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院, 北京100044 摘 要 脫氧核糖核酸穿越納米孔動力學(xué)研究以及利用納米孔開展新型DNA 測序技術(shù)研究是后人類基因組計(jì)劃的熱點(diǎn)之一。本文對生物納米孔、固態(tài)納米孔以及納米孔生物大分子識別技術(shù)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了歸納和總結(jié), 并對該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。關(guān)鍵詞 納米孔; 溶血素蛋白; 生物大分子識別; 綜述2009 05

2、24收稿; 2009 09 30接受本文系國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 10704007 、國家科技支撐項(xiàng)目(Nos . 2006BAD13B08, 2008BADB2B01 和國家科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項(xiàng)目(No . 2005DKA21101 資助*E m ai:l yu ehu. i m a 263. n et ; w j guan86i ascaas . net . cn1 引 言生物體內(nèi)存在大量的膜通道, 用于調(diào)控蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的運(yùn)輸, 并作為新陳代謝的途徑1, 包括細(xì)菌多孔、線粒體通道、一些毒素通道、核孔復(fù)合體以及蛋白引導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道2, 3。生物體中許多進(jìn)程都會涉及到生物聚

3、合鏈穿越嵌入生物膜上通道, 這些通道和生物大分子在空間結(jié)構(gòu)尺度上與納米技術(shù)相吻合, 因此納米技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分子識別的研究提供了更多的可能性。20世紀(jì)90年代, 哈佛大學(xué)B ranton 實(shí)驗(yàn)室和劍橋大學(xué)的Bayley 實(shí)驗(yàn)室先后發(fā)表了單鏈DNA 在電場作用下通過納米孔通道研究發(fā)現(xiàn), 提出了納米孔DNA 測序的設(shè)想46。DNA 序列分析是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一, 也是人類基因組工程的樞軸。傳統(tǒng)用于DNA 測序的方法有雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger 法 和焦磷酸測序法(Pyrosequenci n g 法 是目前使用最普遍的DNA 序列分析技術(shù)。Sanger 法的

4、優(yōu)勢在于可以分析未知DNA 的序列, 且單向反應(yīng)的讀序能力較長, 但是需要昂貴的儀器和試劑。僅測定DNA 單一片斷, 焦磷酸測序技術(shù)可以檢測核苷, 但是會出錯, 因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)很難區(qū)分單一堿基和一串類似的相鄰堿基之間的差異7。可見, 傳統(tǒng)用于DNA 測序的方法技術(shù)要求高、成本貴, 而且容易出錯。因此, 開發(fā)出快捷廉價(jià)而且準(zhǔn)確的DNA 測序方法, 實(shí)現(xiàn)1000美元/人的宏偉基因組測序計(jì)劃, 無疑能顯著促進(jìn)生命科學(xué)的發(fā)展, 為DNA 測序用于人類疾病臨床治療打開了新的大門。利用生物大分子穿越納米孔的特點(diǎn)對實(shí)現(xiàn)這種新型DNA 測序方法具有重要意義。在過去十幾年里, 科學(xué)家利用不同的技術(shù)研究聚合鏈(包括

5、核酸 穿越納米孔, 主要研究方向涉及以下幾個方面8:生物納米孔的自組裝和固態(tài)納米孔的制備研究; 通過單鏈DNA 或RNA 分子穿過納米孔研究其結(jié)構(gòu)、堿基對組成以及動力學(xué)屬性913; 通過不同發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA 的快速辨別和把DNA 分子短暫地駐留在納米空間內(nèi)研究DNA 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性14; 基于單鏈DNA 分子片斷能和 溶血素孔( he m o l y si n 或低聚核苷酸共價(jià)鍵結(jié)合的DNA 雜交性H ybridization 研制生物傳感器15, 16; 一價(jià)或二價(jià)陽離子束縛位置修飾 溶血素孔, 進(jìn)而通過這些束縛的陽離子減少了通過孔的電流研究綁定動力學(xué)17, 18; 在孔道內(nèi)部裝配非共價(jià)鍵的

6、綁定分子適配器進(jìn)而調(diào)整通道電流堵塞6。本文概述生物納米孔結(jié)構(gòu)、固態(tài)納米孔研制以及納米孔生物大分子探測原理, 為納米孔在生物大分子研究方面的應(yīng)用提供思路。2 生物納米孔眾所周知, 生物膜上具有各種各樣的通道, 基本上都是由納米尺度的孔道組成(如離子通道, 水通第38卷2010年2月 分析化學(xué)(FENX I HUAXUE 評述與進(jìn)展 Ch i nese Journa l of A na lytica l Che m i stry 第2期280285道等 。目前, 利用生物納米孔技術(shù)研究DNA 排列次序等特性所采用的主要是葡萄球菌 溶血素孔。該納米孔是眾多生物納米孔中結(jié)構(gòu)組成相對簡單、并且研究比較詳

7、細(xì)的一種溶血素, 是從葡萄球菌中分離出來的一種多肽毒素, 能夠自組裝進(jìn)植烷醇卵磷脂類脂雙分子層膜中19, 20。1986年, M enestrina 通過單低聚合物的電導(dǎo)率估計(jì) 溶血素孔的有效孔徑大約為(1. 14 0. 04 nm21。進(jìn)一步研究表明, 溶血素孔是被溶劑填充的具有蘑菇形的同質(zhì)低聚物構(gòu)成的七聚物孔, 其結(jié)構(gòu)如圖1所示, 總長約為10nm , 直徑約為1. 44. 6nm 20, 其主干部分的高度和直徑分別為5. 2和2. 6nm; 七聚物的原聚體的氨基順時(shí)針和相鄰原聚體結(jié)合, 其富含甘氨酸域的殘基以接近180 角纏繞在七重軸周圍。在C ap 區(qū)域, 原聚體連接通過側(cè)鏈 側(cè)鏈相互

8、作用, 主鏈 主鏈相互作用, 使得在Ste m 區(qū)域Beta 鏈形成Beta 網(wǎng)格。圖1 溶血素蛋白的側(cè)視(A 和正視圖(B , 每條色帶代表七聚物的原聚體20F i g . 1 V i ew perpendicu lar to the sevenfo l d ax is and approx i m ate l y parall e l to the pu tati ve membrane p l ane (A ; V ie w from t he top o f t he structure and parallel to the sevenfo l d ax is . R i bbon

9、representati ons o f the hemo lysi n( HL heptam er w it h each protome r i n a d ifferen t co lor (B 20典型的穿孔實(shí)驗(yàn)中, 單個 溶血素孔在磷脂雙分子層上通過自組裝方式形成的, 其組裝后的微觀模型如圖2所示22。紅色、藍(lán)色、綠色和白色分別表示負(fù)電荷、正電荷、極性和非極性鏈, 綠色小球表示DPPC圖2 溶血素蛋白通道在自然環(huán)境下組裝到磷脂雙分子層上的微觀模型22F ig . 2 M i croscopic m ode l of HL channel i n its nati v e env i

10、ron m ent , a lipi d b ilayer m e mbrane 22磷脂雙分子層的磷原子, 整個模型由288678個原子構(gòu)成。研究表明, 在1m o l/LKC l 條件下, 約為11個K +和11個C l -可以停留在 溶血素孔內(nèi); 在p H >7. 5條件下, 溶血素蛋白孔一直處于穩(wěn)定開啟狀態(tài)23, 尤其在pH 8. 5和溫度在222 時(shí), 發(fā)現(xiàn)通過孔的電流在1d 內(nèi)都保持穩(wěn)定。3 固態(tài)納米孔盡管 溶血素孔能構(gòu)滿足生物大分子穿越動力學(xué)研究, 但是由于生物蛋白壽命和活性的限制, 納米孔DNA 測序技術(shù)的進(jìn)一步研究受到一定限制。理想的生物物理或生物化學(xué)研究應(yīng)采用孔徑穩(wěn)定

11、、物化性能良好的固態(tài)納米孔。S i 3N 4晶體薄膜是最具潛力用來加工生物物理研究用納米孔材料之一。目前, 固態(tài)納米研制孔技術(shù), 取得較好結(jié)果的技術(shù)有同步輻射源技術(shù)24, 25、UV 和離子束平板印刷26, 27顯微鏡電子束技術(shù)28和聚焦離子束技術(shù)(FI B 技術(shù) 29, 30等。其中, 最常見的研制固態(tài)納米孔的聚焦粒子束技術(shù)是1990年代發(fā)展起來的刻蝕手段, 是第一種專門用于為光刻掩模版修補(bǔ)和集成電路修飾的精細(xì)加工技術(shù)。能在薄絕緣固態(tài)膜上制作納米孔的帶有反饋控制的低能離子束濺射系統(tǒng)基本原理圖如圖3a 所示。當(dāng)大量能量為數(shù)ke V 的離子碰撞材料表面, 將會導(dǎo)致表面蝕刻, 通常認(rèn)為每一個激發(fā)離

12、子將會從表面移走一個原子3133。利用離子束形成納米孔基本操作過程圖3b 所示。樣品是通過化學(xué)蝕刻的方法在281第2期丁克儉等:生物大分子納米孔分析技術(shù)研究進(jìn)展 圖3 離子束濺射形成納米孔策略29F i g . 3 Stra tegy t o m ake nanopo res usi ng argon i on bea m sputte ri ng 29a . 反饋控制系統(tǒng)的低能離子束濺射系統(tǒng)(Spu tteri ng re m ovesm ateri al fro m a free st andi ng S i 3N4m e m brane w it h a cavit y; b .固態(tài)S

13、i 3N 4納米孔形成的基本過程(Feedback con trolled ion bea m scu l p ti ng apparat us housed i n a h i gh vacuum cha mb er 。S i 3N 4膜表面中心形成一個倒置的碗狀空腔29, 空腔底部的S i 3N 4層在離子束濺射下逐漸被剝離, 最后形成所需納米孔。系統(tǒng)的單離子探測裝置監(jiān)控穿過納米孔的離子束粒子數(shù)并決定孔徑的大小以及離子束何時(shí)停止蝕刻; 同時(shí)系統(tǒng)還應(yīng)包括樣品溫度控制系統(tǒng)、離子束占空控制系統(tǒng)、樣品架控制系統(tǒng)以及離子束流控制系統(tǒng)。哈佛大學(xué)的Golovchenko 小組利用3 ke VAr +離子

14、獲得孔徑可控的S i 3N 4納米孔29。S tor m 根據(jù)與FI B 刻蝕納米孔基本相同的原理, 利用投射電子顯微鏡(11E M 上的電子束在S i O 2薄膜上刻蝕出孔徑為3nm 左右的小孔。但由于S i O 2薄膜電阻率遠(yuǎn)低于Si 3N 4晶體薄膜, 目前無法通過微電流法來探測生物大分子28。4 納米孔生物大分子探測納米孔生物技術(shù)探測DNA 序列的基本思想, 最早可以追溯到1953年Cou lter 在利用毛細(xì)管脈沖電阻方法統(tǒng)計(jì)電流粒子數(shù)的基礎(chǔ)上提出了納米孔探測的概念34, 1970年, DeB lo is 和B ean 重新對這個概念進(jìn)行了定義35。其納米孔探測的基本原理:當(dāng)生物大分

15、子在外界壓力下穿過由玻璃等絕緣材料制作的納米孔或生物納米孔時(shí)會導(dǎo)致通過小孔離子流的阻塞, 小孔電導(dǎo)率的瞬時(shí)變化反應(yīng)了這個過程, 電流的減低量反映粒子的體積大小, 而電流變化的次數(shù)則反映生物大分子的數(shù)目。隨著現(xiàn)代電流放大器技術(shù)的發(fā)展, Cou lter 方法在分子尺度領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用36。1994年, B ezrukov 等的實(shí)驗(yàn)證明, 在系統(tǒng)中加入乙烯乙二醇時(shí), 通過直徑為20nm 丙甲甘肽(Ala m ethic i n 通道的粒子流減少, 對電流波動的分析獲得了聚合鏈在通道內(nèi)的擴(kuò)散因子37。近年來, 科學(xué)家們已利用納米孔開展了許多有意義的生命科學(xué)研究(原理示意圖如圖4 3641。單鏈DN

16、A 或RNA 分子可以加入到膜兩邊的 C is 或 Trans 容器中, Trans 電極的正電位導(dǎo)致帶有負(fù)電荷的聚合鏈進(jìn)入 H L 孔并從膜的一邊滑動到膜的另一邊, 在聚合鏈穿越孔時(shí), 電流急劇下降到原電流的10%左右42, 43。圖5是溶液中含有3個堿基數(shù)為100的單鏈DNA 分子, 整個過程發(fā)生3次電流阻塞現(xiàn)象37。多聚核苷酸鏈穿越過程的穿越時(shí)間(t 、阻塞發(fā)生的間隙( t 以及阻塞電流(I B 可定量的檢測出來, 研究表明, t 對多聚核苷酸濃度非常敏感, 而阻塞電流和穿越時(shí)間則和多聚核苷酸的基本參數(shù)有關(guān)。M e ller 等科學(xué)家檢測單鏈DNA 分子穿越 溶血素孔導(dǎo)致阻塞電流振幅起伏

17、、 時(shí)間滯留等圖案的 圖4 納米孔DNA 探測裝置示意圖3841F i g . 4 Sche m a tics o f nanopore detec tion 3841A . 固態(tài)納米孔DNA 探測示意圖(Soli d s t ate nanopore detecti on ; B. 溶血素孔DNA 探測示意圖( HL detection 。 圖5 穿越事件電流信號表示圖42F i g . 5 T hree translocati on events 42The b locked cu rren t corres pond s to tran slocati on ofDNA po l ynu

18、cle oti d es t h rough HL c h anne. l282 分析化學(xué)第38卷不同, 區(qū)分不同DNA /RNA均聚物Po l y A, Po l y C , Poly U, Po l y dC 以及Poly T 等, 聚合物Po ly A 30C 70結(jié)構(gòu)組成中的兩段嘌呤和嘧啶, 也通過此種方法成功鑒別出來12, 13, 4145。Bay lay 研究組通過對 溶血素孔內(nèi)表面電荷進(jìn)行操縱進(jìn)而對生物納米孔改性, 提高不同的DNA 堿基占據(jù)這個納米孔的時(shí)候產(chǎn)生的電流的擴(kuò)散, 同時(shí)他們采用核酸外切酶讓DNA 分子以一次一個堿基的速度通過小孔, 這兩種技術(shù)的結(jié)合可以辨別長串的A,

19、T, C 和G 堿基, 而且還能進(jìn)行更精細(xì)的識別, 諸如識別隨機(jī)序列中的A, C , G, T 這4個堿基中的任何一個, 如圖6所示。不過這種技術(shù)在單堿基層次上尚未達(dá)到可靠的分辨率要求4648。 圖6 單通道記錄的d GM P, dTM P, d AM P 和dC M P 穿越 溶血素孔的信號47F i g . 6 N ucleoti de event distr i buti ons w it h per m anent adapter si ng le channe l reco rding fro m onebionanopo r show ing dGM P , d TM P, dAM

20、 P and dC M P d i scri m i nati on , w it h co l oured bands added torepresent t he resi dual current distributi on fo r each nuc leo ti de 47迄今, 科學(xué)家對于納米孔甄別DNA 特性實(shí)驗(yàn)獲得的研究結(jié)果主要包括:生物大分子是以一定單體次序穿越 溶血素孔; 每一次穿越事件可由電流信號的變化甄別; 能夠測量生物大分子長度和空間結(jié)構(gòu)等。然而, 溶血素孔探測存在一些局限性, 如, 溶血素孔嵌入的凝脂雙分子層支架的易破壞性, 對環(huán)境因素極其敏感性, 而這些環(huán)境因素恰

21、恰是控制DNA 結(jié)構(gòu)的重要因素49; 除此之外, 溶血素內(nèi)部孔徑也僅約為1. 5n m, 只能容許單鏈DNA, RNA 和聚核苷酸穿越, 限制雙鏈DNA, RNA 的穿越44。因此并不能用它來研究雙鏈DNA 、RNA 或聚核苷酸等的結(jié)構(gòu)性質(zhì), 也不可能利用它直接研究DNA 或組蛋白的動力學(xué)結(jié)構(gòu)。由于這些條件的限制, 近年來, 固態(tài)納米孔(So li d state nanopo re 逐漸成為納米孔生物大分子識別研究的熱點(diǎn)5057。目前利用固態(tài)納米孔探針開展DNA 穿孔研究, 實(shí)驗(yàn)的偏置電壓通常設(shè)置約為120mV, 穿孔事件、穿孔時(shí)間t d 和電流偏差 I b 信息由膜片鉗系統(tǒng)獲取。最近, 普

22、渡大學(xué)B rick 納米技術(shù)中心的研究人員在固相納米孔檢測DNA 技術(shù)上取得了突破性的進(jìn)展46。Bashir 研究組利用絕緣體硅材料(S ilicon on insulator 構(gòu)建了固相納米孔通道, 并用發(fā)夾(Ha irpin loop 結(jié)構(gòu)DNA 探針修飾納米孔, 他們發(fā)現(xiàn)在電場的作用下與探針DNA 完全匹配的單鏈DNA 能夠迅速通過孔道, 形成狹深的電脈沖圖譜, 而即使只有一個堿基不匹配的錯配DNA, 通過時(shí)速度緩慢、也無特征峰谷形成。該項(xiàng)研究實(shí)現(xiàn)了生物納米孔的選擇性與固相納米孔的穩(wěn)定性的結(jié)合, 為精確模擬生物膜提供了更有效的納米材料模型, 從而有望實(shí)現(xiàn)在芯片上對少量、低濃度的蛋白質(zhì)、核

23、酸等生命大分子的測定。可以預(yù)見, 隨著該納米孔研究的進(jìn)一步完善, 可以快速提高傳統(tǒng)DNA 的測序效率, 擴(kuò)展DNA 測序的應(yīng)用領(lǐng)域, 為后基因組學(xué)提供有力的研究手段, 以及進(jìn)一步為臨床醫(yī)藥提供更加精準(zhǔn)和個性化的診療手段。除了利用納米孔研制新型DNA 測序技術(shù)外, 科學(xué)家開始嘗試?yán)眉{米孔研究DNA 與組蛋白間的相互作用。在前人的基礎(chǔ)上, 王鵬業(yè)等50, 57提出通過利用FI B 技術(shù)研制的納米孔研究DNA 分子與核小體相互作用方案。眾所周知, DNA 分子通過與帶正電的組蛋白靜電相互作用使得DNA 分子緊密纏繞到核小體上, 因此在適當(dāng)?shù)耐饬ψ饔孟? 纏繞在核小體上的DNA 分子將被分開。DNA

24、 雙螺旋是由兩股DNA 單鏈逆向繞制形成的。具有不同堿基數(shù)目、排列次序的ds DNA 片段, 與組蛋白結(jié)合成核小體, 其相互作用力、空間結(jié)構(gòu)、構(gòu)象等不相同, 當(dāng)其被剝離并穿越納米孔時(shí), 引起電流阻塞振幅、阻塞時(shí)間等變動。雙鏈DNA 與組蛋白八聚體結(jié)合在不同的位點(diǎn)上, 這些結(jié)合位點(diǎn)也具有不同的結(jié)構(gòu)。在電場力作用下, dsDNA 從八聚體上被剝離下來的過程以及dsDNA 拉伸的扭曲等將導(dǎo)致其它結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變等。利用納米孔研究DNA 與核小體結(jié)合動力學(xué), 其基本原理與利用納米孔進(jìn)行DNA 的超快速測序技術(shù)原理基本相同。不過由于納米孔的空間結(jié)構(gòu)和阻擋力, 使組蛋白不能穿越, 從而誘使DNA 從組蛋白八聚體

25、上分離下來。因此, 通過準(zhǔn)確檢測DNA 分子穿孔過程中引起的電流阻塞的振幅起伏、時(shí)間遲滯等特性, 可將DNA 與組蛋白的相互作用的一些性質(zhì)反映出來。5 總結(jié)和展望納米孔作為一種新型的納米探測器, 其在生物大分子方面的研究方興未艾, 離子流阻塞效應(yīng)、電流特征檢測以及DNA 特征信息成為DNA 的超快速測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵。但是由于生物大分子聚合物鏈穿越納米孔是一個非常復(fù)雜的科學(xué)問題, 其過程涉及納米孔與聚合物鏈的空間結(jié)構(gòu)排列、流體動力學(xué)、以及納米孔 聚合物鏈間的相互作用等, 盡管目前探測器靈敏度已經(jīng)足夠高, 但是生物大分子鏈在受限空間中構(gòu)像變化以及其運(yùn)動的詳細(xì)特征還無法直接觀測到; 一些非常重要的

26、物理量也只能通過間接方法獲得。要達(dá)到實(shí)用階段還面對許多挑戰(zhàn)性問題, 例如生物大分子穿越納米孔的穩(wěn)定性差、穿越速度快以及特征信號弱等。隨著納米孔技術(shù)難關(guān)的攻克, 今后納米孔技術(shù)的應(yīng)用研究, 主要將集中以下幾個方面:利用納米孔探測技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合破譯生物大分子各級結(jié)構(gòu)與功能; 利用納米孔研究生物大分子之間的相互作用; 利用納米孔技術(shù)開發(fā)疾病診斷系統(tǒng)和新型藥物傳輸系統(tǒng)等, 其在生命科學(xué)中的應(yīng)用必將得到拓寬, 許多生命活動規(guī)律將揭示, 納米孔技術(shù)必將給人類的生活帶來深遠(yuǎn)影響。R eferences1 Bezrukov S M. J. M e m br B iol . , 2000, 174(1

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