ELISA原理、方法及操作細節(jié)

1、ELISAELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗主講人：劉主講人：劉 暢暢 研究生研究生導導 師：馬學恩師：馬學恩 教教 授授ELISAELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）（酶聯(lián)免疫吸附試驗）Enzymes linked immunosorbent assay簡簡 介介19711971年，瑞典學者年，瑞典學者EngvailEngvail和和PerlmannPerlmann、荷蘭學者、荷蘭學者Van SchuursVan Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗。附試

2、驗。ELISA ELISA 就是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反就是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合而建立的一種新技術。應相結合而建立的一種新技術。該技術應用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原該技術應用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原- -抗抗體系統(tǒng)均可用以檢測。體系統(tǒng)均可用以檢測。酶和抗體或抗原結合后，既不改變抗體與抗原酶和抗體或抗原結合后，既不改變抗體與抗原免疫學反應的特異性，也不影響酶本身的酶學免疫學反應的特異性，也不影響酶本身的酶學活性，即在相應而合適的作用底物參與下，使活性，即在相應而合適的作用底物參與下，使基質水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型基質水解而呈色，或使供氫體由無

3、色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產物可用肉眼、變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可用分光光光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可用分光光度計加以測定。呈色反應顯示了酶的存在，從度計加以測定。呈色反應顯示了酶的存在，從而證明發(fā)生了相應的免疫反應。而證明發(fā)生了相應的免疫反應。所以，這是一種特異而敏感的技術，可以在細所以，這是一種特異而敏感的技術，可以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克，甚至納米水平上對其進行定量?；蛟谖⒖耍踔良{米水平上對其進行定量。基基 本本 原原 理理l先將已知的抗體或抗原結合在某種

4、固相載體上，先將已知的抗體或抗原結合在某種固相載體上，并保持其免疫活性并保持其免疫活性。l測定時，將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不同步測定時，將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應。驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應。l用洗滌的方法分離抗原用洗滌的方法分離抗原-抗體復合物和游離成分。抗體復合物和游離成分。l 然后加入酶的作用底物催化顯色，進行定性或定然后加入酶的作用底物催化顯色，進行定性或定量。量。方方 法法 類類 型型酶聯(lián)免疫吸附試驗的主要技術類酶聯(lián)免疫吸附試驗的主要技術類型有雙抗體夾心法、間接法、競型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等。爭法、捕

5、獲法等。1 1，雙抗體夾心法：，雙抗體夾心法：此法常用于檢測抗原此法常用于檢測抗原它是利用待測抗原上的兩個抗原決定簇它是利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和和B分別與固相載體上的抗體分別與固相載體上的抗體A和酶標記抗體和酶標記抗體B結結合，形成合，形成抗體抗體A-待測抗原待測抗原-酶標抗體酶標抗體B復合物復合物，復合物的形成量與待測抗原含量成正比，屬非復合物的形成量與待測抗原含量成正比，屬非競爭性反應類型。競爭性反應類型?？箍?體體 A A待測抗原待測抗原酶標抗體酶標抗體包被物包被物2 2，間接法測定抗體，間接法測定抗體此法常用于測定抗體此法常用于測定抗體將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與將

6、已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與抗原結合后再與酶標二抗結合，形成抗原結合后再與酶標二抗結合，形成抗原抗原-待待測抗體測抗體-酶標二抗的復合物酶標二抗的復合物，復合物的形成量，復合物的形成量與待測抗體量成正比，屬非競爭性反應類型。與待測抗體量成正比，屬非競爭性反應類型?？箍?原原待測抗體待測抗體酶標二抗酶標二抗包被物包被物3 3，競，競 爭爭 法法此法既可用于檢測抗原和半抗原，此法既可用于檢測抗原和半抗原，也可以用于檢測抗體也可以用于檢測抗體用酶標抗原（抗體）與待測的非標記抗原用酶標抗原（抗體）與待測的非標記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的限量抗體（抗體）競爭性的與固相載體上的限量抗體（抗

7、原）結合，待測抗原（抗體）多，則形（抗原）結合，待測抗原（抗體）多，則形成非標記復合物多，酶標抗原與抗體結合就成非標記復合物多，酶標抗原與抗體結合就少，也就是酶標記復合物少，因此，顯色程少，也就是酶標記復合物少，因此，顯色程度與待測物含量成反比。度與待測物含量成反比。限量的的抗體限量的的抗體酶標抗原酶標抗原 樣品抗原樣品抗原酶標多于樣品酶標多于樣品顯色程度深顯色程度深樣品多于酶標樣品多于酶標顯色程度淺顯色程度淺顯色程度與待測物含量成反比顯色程度與待測物含量成反比包被物包被物4 4，捕獲法（反向間接法），捕獲法（反向間接法）主要用于測定血清中某種抗體亞成分主要用于測定血清中某種抗體亞成分以目前最

8、常用的以目前最常用的IgM測定為例，因血清中針對測定為例，因血清中針對某種抗原的特異性某種抗原的特異性IgM和和IgG同時存在，而后者同時存在，而后者可干擾可干擾IgM的測定。因此，先針對的測定。因此，先針對IgM的第二抗的第二抗體體(如羊抗人如羊抗人IgM鏈抗體）連接于固相載體，用鏈抗體）連接于固相載體，用以以“捕獲捕獲”樣品中所有樣品中所有IgM；洗滌除去；洗滌除去IgG等無等無關物質，然后加入特異性抗原與待測關物質，然后加入特異性抗原與待測IgM結合；結合；再次加入抗原特異的酶標抗體；最后形成固相再次加入抗原特異的酶標抗體；最后形成固相二抗二抗-IgM-抗原抗原-酶標抗體復合物，加酶底物

9、顯酶標抗體復合物，加酶底物顯色后，即可對待色后，即可對待IgM進行定性和定量測定。進行定性和定量測定。針對針對IgM的第二抗體的第二抗體待測物待測物 其中含有其中含有IgM和和IgG特異性抗原與特異性抗原與IgM結合結合酶標抗體酶標抗體包被物包被物IgGIgG等無關物質等無關物質被洗脫被洗脫具具 體體 步步 驟驟l 包被包被l 封閉封閉l 加待測物加待測物l 加一抗，二抗加一抗，二抗 ，或抗原等，或抗原等l 顯色顯色包包 被被l 用包被液稀釋包被抗體至合適濃度，包被酶用包被液稀釋包被抗體至合適濃度，包被酶聯(lián)板（聚乙烯微量反應板），每孔聯(lián)板（聚乙烯微量反應板），每孔100。l用保鮮膜包好用保鮮膜

10、包好 ，4過夜。過夜。 如急用，包被如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好后，清洗也可用，但最好 過夜。過夜。l 次日棄去孔內溶液，并在面巾紙上拍干。次日棄去孔內溶液，并在面巾紙上拍干。l 用用PBST洗液，洗洗液，洗45次。次。 每次在洗板機清洗酶聯(lián)板上震蕩每次在洗板機清洗酶聯(lián)板上震蕩23min后，后，在面巾紙上拍干后進行下一次清洗或下一步。在面巾紙上拍干后進行下一次清洗或下一步。包包 被被 液液0.05M PH 9.6 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液Na2 2CO3 3 1.59 g ；NaHCO3 3 2.93g ； 加蒸餾水至加蒸餾水至1000mlPBST 洗洗 液液2000ml PBS +

11、 1ml Tween-20PBS：NaCl 8g ； KCl 0.2g ；Na2 2HPO4 4 1.42g；KH2 2PO4 4 0.27g；加加1000ml蒸餾水定容，調蒸餾水定容，調PH至至7.4洗洗 板板 機機封封 閉閉l用封閉液封閉，每孔用封閉液封閉，每孔100。 室溫下，在微量振蕩器上，封閉室溫下，在微量振蕩器上，封閉2h。l棄去孔內溶液，并在面巾紙上拍干。棄去孔內溶液，并在面巾紙上拍干。l 用用PBST洗液，洗洗液，洗45次。（同包被）次。（同包被）l 用保鮮膜包好，用保鮮膜包好，4可保存一個月。可保存一個月。封封 閉閉 液液l 10 % 10 % 小牛血清小牛血清 （1ml1m

12、l小牛血清加到小牛血清加到9ml 19ml 1PBSPBS中混勻）。中混勻）。l 5%5%脫脂奶粉（用洗液稀釋）脫脂奶粉（用洗液稀釋）加標準樣及樣品加標準樣及樣品l 待測樣或標準一抗：待測樣或標準一抗： 用用PBST洗液進行稀釋到適合濃度，每孔洗液進行稀釋到適合濃度，每孔100l，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器上孵育上孵育2小時。清洗。小時。清洗。l 二抗：二抗： 用用PBST洗液進行稀釋到適合濃度，每孔洗液進行稀釋到適合濃度，每孔100l，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器上孵育上孵育1小時。清洗。小時。清洗。注注 意意l

13、抗體抗原反應比較快，一般抗體抗原反應比較快，一般1212個小時就個小時就達到峰值。延長反應時間容易出現非特異達到峰值。延長反應時間容易出現非特異結合，但反應時間不能少于結合，但反應時間不能少于1.51.5小時。小時。l 二抗的使用濃度（一般，二抗的使用濃度（一般，1 1：1000010000稀釋）稀釋）應當進行預實驗確定，二抗的反應時間不應當進行預實驗確定，二抗的反應時間不能過長，容易出現非特異反應。一般，反能過長，容易出現非特異反應。一般，反應應40604060分即可。分即可。OPD OPD 顯顯 色色l臨用前取臨用前取A A液液5.14ml5.14ml，B B液液 4.86ml4.86ml

14、加入加入OPD (OPD (鄰苯二胺，在鄰苯二胺，在-20-20中保存）中保存）0.0040g0.0040g（約（約4 4小片），溶解后加入小片），溶解后加入50l50l的的30%H30%H2 2OO2 2，配成顯色液。（，配成顯色液。（OPDOPD要充分混要充分混勻，否則容易出現個別孔顏色太深）勻，否則容易出現個別孔顏色太深）l 顯色液每孔顯色液每孔100l100l。避光顯色。避光顯色1520min1520min。l 用用2mol2molL HL H2 2SOSO4 4終止反應，每孔終止反應，每孔50l50l顯顯 色色 液液l A液：液：0.2mol L Na2HPO4 Na2HPO412H

15、2O 71.7g加水至加水至1000mll B液：液：0.1 mol L 檸檬酸檸檬酸 檸檬酸檸檬酸 19.2g 檸檬酸，加水至檸檬酸，加水至1000ml結結 果果 判判 定定酶標測定儀檢測（酶標測定儀檢測（429nm429nm），），測定測定ODOD值：值：待測孔（待測孔（P P）與對照孔（）與對照孔（NN）的比值（）的比值（P P：NN）大于）大于1.51.5或或2 2者為陽性者為陽性注意：要有陰性，陽性對照注意：要有陰性，陽性對照。應應 用用ELISA ELISA 法由于測定靈敏、特異、操作簡便、法由于測定靈敏、特異、操作簡便、酶標記試劑比較穩(wěn)定、易于自動化、無反酶標記試劑比較穩(wěn)定、易于自動化、無反射性污染，且易與其他相關技術偶聯(lián)，使射性污染，且易與其他相關技術偶聯(lián)，使其成為目前應用最廣泛而且發(fā)展最快的一其成為目前應用最廣泛而且發(fā)展最快的一種免疫測定技術。市場上符合質量要求的種免疫測定技術。市場上符合質量要求的商品試劑盒（提供有包裝好的固相載體、商品試劑盒（提供有包裝好的固相載體、酶標記物及其底物和洗滌液等全套試劑成酶標記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動或半自動檢測儀不斷研究發(fā)明分）和自動或半自動檢測儀不斷