重慶大學考研分子生物學題庫+答案

1、2010年 高等分子生物學高級分子生物學1.試述利用基因工程的技術(shù)調(diào)控基因表達的主要方法原位雜交技術(shù)原位雜交(In Situ Hybridization,ISH)是用標記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。通?？梢苑譃閮纱箢悾?、RNA原位雜交：用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，就可以通過檢測放射性標記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達產(chǎn)物在細胞水平上作出定性定量分析；2、熒光原位雜交(Fluorescence I

2、n Situ Hybridization,FISH)：首先對于寡核苷酸探針做特殊修飾和標記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相偶聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體的位置。定點突變技術(shù)定點突變是重組DNA進化的基礎(chǔ)，該方法通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。RNAi技術(shù)RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷體內(nèi)靶

3、基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。其過程一般為：1、在Dicer的參與下，細胞中的雙鏈RNA首先被降解形成21-25個核苷酸的小片段雙鏈RNA(siRNA)；2、siRNA中的反義鏈指導合成一種被稱為RNA誘導的沉默復合體(RISC)的核蛋白體；3、RISC再介導切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾基因表達的功能。2.論述原核生物和真核生物基因表達調(diào)控的異同答：1、真核生物基因組大,染色體數(shù)量多,且結(jié)構(gòu)復雜,存在基因家族和斷裂基因；原核生物基因組小,染色體數(shù)量少,結(jié)構(gòu)簡單,有重疊基因和操縱子結(jié)構(gòu)，基因表達調(diào)控可以在復制、擴增、基因激活、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后

4、等多級水平上進行,但轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是主要的。真核生物基因表達調(diào)控機制發(fā)生在染色體活化、基因轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯及翻譯后加工等多水平的調(diào)節(jié)，事件也復雜的多。2、真核生物基因表達以正調(diào)控為主，基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān),真核基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細胞核(線粒體基因的轉(zhuǎn)錄在線粒體內(nèi)),需對內(nèi)含子精確剪接加工，翻譯則多在胞漿,兩個過程是分開的?；虮磉_調(diào)控的環(huán)節(jié)比原核生物更多。原核生物中,營養(yǎng)條件和環(huán)境因素對基因表達調(diào)控起舉足輕重的作用，mRNA在形成過程中與核糖體混合在一起，即轉(zhuǎn)錄和翻譯過程相耦聯(lián)。3.簡述互補篩選（藍白斑篩選）適用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的載體，如 pUC系列等

5、，其原理是：載體含有LacZ的調(diào)控序列和N端146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點。當這種載體進入可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞后（質(zhì)粒和宿主細胞編碼的片段各自都沒有酶活性），它們可以融為一體，形成具有酶學活性的蛋白質(zhì)，這種現(xiàn)象叫互補。由互補而產(chǎn)生的 Lac+ 細菌在呈色底物 X-gal和誘導劑IPTG存在下形成藍色菌落。當外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，導致產(chǎn)生無互補能力的氨基端片段。因此，帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。通過呈色反應即可初步識別可能帶有重組質(zhì)粒的菌落。通過小量制備質(zhì)粒DNA進行限制酶切分析，即可確定這些質(zhì)粒的

6、結(jié)構(gòu)。4.簡述菌落PCR篩選該方法是以轉(zhuǎn)化菌單個克隆為模板，采用特異性引物或通用引物對目的基因進行PCR擴增，然后通過凝膠電泳等手段來鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，最后可以經(jīng)提取質(zhì)粒DNA進行酶切和質(zhì)粒PCR雙重鑒定以及測序分析進一步確認菌落PCR的結(jié)果。5.簡述雜交探針技術(shù)的原理和方法在制備好合適的基因文庫后，如果用可獲得目的基因的互補DNA或RNA做探針，就可以利用核酸雜交技術(shù)鑒定出特定的重組體克隆。原理：任兩條單鏈核酸分子都有相互形成堿基對的趨勢，但形成的大多數(shù)分子對由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，如果多聚核苷酸鏈是互補的，堿基對的大量形成使雙鏈分子穩(wěn)定。步驟：1、把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到

7、硝酸纖維膜上，處理除去雜質(zhì)，只留下DNA，使DNA分子變性，雙螺旋之間的氫鍵斷裂2、短時間的加熱會使這些單鏈DNA分子牢固結(jié)合到膜上。DNA分子與膜結(jié)合其堿基是自由的，可以自由配對。3、然后把探針加上標簽，加熱變性，再加到適宜核酸退火的化學溶液中與膜結(jié)合。經(jīng)過一段時間，等雜交發(fā)生后，洗去沒有結(jié)合的探針，干燥，檢測結(jié)合的探針的位置，從而篩選出想要獲得陽性克隆。6.對天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建、改造通常需要對質(zhì)粒哪些方面進行操作、改進?答：對于天然質(zhì)粒應該做以下幾方面的操作、改進：1.刪除一些非必要的區(qū)段及對宿主有不良影響的區(qū)段2.削減載體的分子量，是載體具有更大的容納外源片段的能力3.加上易于選擇或檢測

8、的標記，以便篩選出陽性克隆4.限制性內(nèi)切酶的酶切位點的改造，便于外源基因插入到載體的特定位置5.加上一些調(diào)控元件，有利于基因的表達6.安全性改造（因為是簡答題，以下四點可以不要，但建議最好要）:（1）非傳遞性和不被帶動轉(zhuǎn)移。在基因工程操作中，不希望載體能夠進行自主傳遞，也不希望被帶動轉(zhuǎn)移；（2）具有條件致死突變。如溫度敏感時就喪失復制能力，可防止克隆基因擴散，只存在于限定的宿主細胞中；（3）一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因為重組后可能給宿主帶來突變；（4）有較小的宿主范圍。7. 大腸桿菌乳糖操縱子的主要結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)機制。答：大腸桿菌的乳糖操縱子（LAC操縱子）含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因，分

9、別編碼半乳糖苷酶、透酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱基因O、一個啟動子P及一個調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種與O基因結(jié)合的阻遏蛋白，使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個酶的編碼基因由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達。調(diào)節(jié)機制：分阻遏蛋白的負調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。1、阻遏蛋白的負調(diào)節(jié)：在沒有乳糖存在時，I基因表達的乳糖阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄啟動；當有乳糖存在時，經(jīng)透酶催化、轉(zhuǎn)運進入細胞，再經(jīng)原先存在于細胞中的少數(shù)-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

10、別乳糖，與阻遏蛋白結(jié)合，導致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使-半乳糖苷酶分子急劇增加。2、CAP的正調(diào)節(jié)：當沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時，cAMP與CAP結(jié)合，這時CAP結(jié)合在乳糖啟動序列附近的CAP位點，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性；當葡萄糖存在時，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，因此乳糖操縱子表達下降。8. 試說明真核細胞與原核細胞在基因轉(zhuǎn)錄，翻譯及DNA的空間結(jié)構(gòu)方面存在的主要差異，表現(xiàn)在哪些方面？比較原核、真核基因組異同（1）染色體方面：原核生物為環(huán)狀DNA分子，且DNA裸露或結(jié)合少量蛋白質(zhì)，只有一個基因連鎖群；真核生物為線性雙鏈DNA分子，且DNA同組蛋白和非組蛋白結(jié)合，有2

11、個以上基因連鎖群。（2）染色體遺傳物質(zhì)：原核生物為質(zhì)粒，真核生物為細胞器基因組。（3）轉(zhuǎn)錄單元：原核生物為多順反子，真核生物為單順反子，基因家族。（4）DNA序列：原核生物無或很少有重復序列，真核生物有重復序列。（5）基因表達：原核生物RNA和蛋白質(zhì)在同一區(qū)間合成，有重疊基因；真核生物RNA在核中合成和加工，蛋白質(zhì)在細胞中合成，有斷裂基因。比較原核、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程異同答：原核生物： 起始過程需RNA聚合酶核心酶，由亞基辨認起始點（-35bp區(qū)）。在這一區(qū)段酶與模板的結(jié)合松弛，酶移向-10區(qū)并跨入轉(zhuǎn)錄起始點。延長過程的核苷酸聚合僅需核心酶催化。終止分依賴因子的和不依賴因子的轉(zhuǎn)錄終止。 真核生

12、物：轉(zhuǎn)錄起始前的-25bp區(qū)段有啟動子的核心序列TATAbox。此外DNA分子上還具有其他可影響轉(zhuǎn)錄的順式作用元件，以及能辨認和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段的反式作用因子。真核生物RNA聚合酶不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。真核生物的轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似。真核生物mRNA有polyA尾結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進去的。轉(zhuǎn)錄不是在polyA位置上終止，而是超過數(shù)百甚至上千核苷酸后才停頓。比較原核、真核生物的翻譯異同1、原核生物與真核生物核蛋白體的組成不同。2、真核生物肽鏈合成起始過程與原核生物相似但更復雜。真核生物有不同的翻譯起始成分，起始因子種類更多，起始甲硫氨酸不需甲基化等。成熟的真核

13、mRNA有5'帽子和3'polyA尾結(jié)構(gòu)。3、真核生物肽鏈合成的延長過程與原核生物基本相似，只是有不同的反應體系和延長因子。4、真核生物的翻譯終止過程與原核生物相似。9.試說明色氨酸操縱子（Trp operon)在原核基因表達調(diào)控中的調(diào)控機制和重要作用。 色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)系：（1）含有5種結(jié)構(gòu)基因：TrpE, D, C, B, A；（2）它的調(diào)控結(jié)構(gòu)：啟動子，操縱子，前導序列，弱化子。（3）阻遏物Trp基因：它與Trp操縱子相距較遠。大量Trp存在時，大腸桿菌的5種酶的轉(zhuǎn)錄同時受到抑制，Trp不足時，這5酶基因開始轉(zhuǎn)錄。前導序列中含有衰減子區(qū)域，在前導序列中第10位和第11位有

14、相鄰兩個色氨酸密碼子，參與轉(zhuǎn)錄弱化機制，弱化子對RNA聚合酶的影響依賴于前導肽翻譯中核糖體所處的位置：（1）當Trp濃度高時，可完整翻譯成短肽，核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄前，核糖體就到達2區(qū)，這樣使2-3區(qū)不能配對，3-4區(qū)可自由配對形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止。Trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因被關(guān)閉而不再合成色氨酸。（2） 當Trp濃度低時，負載有Trp的轉(zhuǎn)運RNA也少，這樣翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢，當4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時，核糖體才到達1區(qū)，這時的前導區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3區(qū)配對，不形成3-4區(qū)配對的終止結(jié)構(gòu)，故轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進行，直到將Trp操縱子的結(jié)構(gòu)基

15、因全部轉(zhuǎn)錄。11. 闡述酵母轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的調(diào)控方式及其在酵母雙雜合系統(tǒng)(yeast two hybrid system)中的應用。答：GAL4由兩個結(jié)構(gòu)域組成，一個是DNA結(jié)合域BD，一個是轉(zhuǎn)錄激活域AD，這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但具有完整激活功能的GAL4必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域。當AD與BD結(jié)合后，形成的完整轉(zhuǎn)錄因子可以激活被BD結(jié)合的基因的表達。    將編碼待測蛋白X的DNA序列同編碼GAL4 BD的DNA序列整合在一個載體上，表達產(chǎn)生X-GAL4雜合蛋白；將編碼蛋白質(zhì)Y的DNA序列同編碼GAL4 AD的DNA序列整合在一個載體上，表達產(chǎn)生Y-GAL

16、4雜合蛋白。這兩種雜合蛋白都有核定位序列，當這兩種載體同時轉(zhuǎn)化入酵母細胞后，表達產(chǎn)生的兩種蛋白都定位在核內(nèi)。如果X和Y有相互作用，則分別融合在二者上的AD和BD就會組合成為一個完整的轉(zhuǎn)錄因子，激活與BD結(jié)合的報告基因的表達，從而知道待測蛋白間是否有相互作用。12. 分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？常用的工具酶1、限制性核酸內(nèi)切酶：是細菌產(chǎn)生的一類能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶。2、DNA連接酶：將兩段DNA分子拼接起來的酶。3、DNA聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。4、逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶，產(chǎn)物DNA又稱互補D

17、NA。5、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端。6、堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基團。7、依賴DNA的RNA聚合酶：識別特異性啟動子，RNA轉(zhuǎn)錄。良好載體的條件1、必須有自身的復制子；2、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點，即多克隆位點，以供外源DNA插入；3、載體應具有可供選擇的遺傳標志，以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子；4、載體分子必須有足夠的容量；5、可通過特定的方法導入細胞；6、對于表達載體還應具備與宿主細胞相適應的啟動子、前導順序、增強子、加尾信號等DNA調(diào)控元件。13. SANGER雙脫氧鏈終止法的原理？答：DNA鏈中核苷酸以3,5-磷酸二酯

18、鍵連接，合成DNA所用的底物是2-脫氧核苷三磷酸。2,3ddNTP與普通dNTP不同，它們在脫氧核糖的3位置缺少一個羥基。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒有3羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。在DNA合成反應混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競爭，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位置間的距離。在4組獨立酶反應中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。14. 核酸分子雜交的原理

19、、條件、影響因素？原理：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴格按照堿基互補的原則進行，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也能在DNA和RNA之間進行。因此，當用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。必要條件：一是必需的特異的DNA探針；二是必需的基因組DNA。影響因素：1、核酸濃度越大，復性速度越快。探針長度要適當。2、溫度：溫度過高不利于復性，溫度過低，少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離。 3、低離子強度下，核酸雜交緩慢，隨著

20、離子強度的增加，反應速率增加。 4、雜交液中甲酰胺能降低核酸雜交的TM值。5、核酸分子的復雜性，即存在于反應體系中的不同順序的總長度。6、在雜交前應對非特異反應位點進行封閉，以減少其對探針的非特異性吸附作用。15. PCR的基本原理和過程？答：基本原理是依據(jù)細胞內(nèi)DNA半保留復制的機理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過程即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個步驟構(gòu)成的一個循環(huán)，此循環(huán)的反復進行，就可使目

21、的DNA得以迅速擴增。1、變性：94，模板雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA。2、退火：引物單鏈DNA雜交鏈。3、延伸：溫度至70 左右， Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3末端為起點的53DNA鏈延伸反應，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應的模板PCR，如此反復，使目的DNA得到高效快速擴增。16. PCR的反應條件？1、PCR反應的緩沖液：Tris-HCl緩沖液。KCl 促進引物的退火，濃度太高時會抑制Taq DNA聚合酶活性。必要時加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級結(jié)構(gòu)，提高PCR反應特異性。2、鎂離子

22、濃度：Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+濃度過低，會顯著降低酶活性。Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強。Mg2+濃度還會影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴增片段的產(chǎn)率。   3、底物濃度： dNTPs濃度過高可加快反應速度，也增加堿基的錯配率和實驗成本。降低濃度會導致反應速度下降，可提高反應的特異性。4種dNTP必須以等摩爾濃度配制，以減少PCR反應的錯配誤差并提高使用效率。4、Taq DNA聚合酶：75-80時具有最高的聚合酶活性，150個核苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95仍有活性。5、引物：引物濃度偏高會引起錯配或非特異性擴增、生成引物二

23、聚體，使目的DNA片段產(chǎn)率下降。退火溫度與引物Tm值有關(guān)，引物Tm值在55-80 范圍較為理想。6、反應溫度和循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。17. 影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達的因素？答：1、啟動子的強弱；2、基因的劑量；3、影響RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素：SD序列、mRNA；4、外源基因密碼子的選擇；5、表達產(chǎn)物的大小；6、表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性。18. 大腸桿菌系統(tǒng)表達外源基因必須具備的條件？答：1、要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子；2、表達的外源片段要位于大腸桿菌啟動

24、子的下游，并形成正確的閱讀框架；3、轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì)。4、蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定，不易被細胞內(nèi)蛋白酶快速降解，且對宿主無害。19. 真核細胞表達外源基因的條件？答：1、首先必須具備哺乳動物細胞表達的功能元件。要求哺乳動物細胞表達載體帶有能在真核細胞中表達外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；2、注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細胞，不同類型的細胞具有不同的特性；3、注意選擇適當?shù)倪x擇標記。20. 轉(zhuǎn)基因動物的概念、原理及應用？答：概念、原理：借助基因工程技術(shù)把外源目的基因?qū)肷臣毎?、胚胎干細胞和早期胚胎，并在受體染色體上穩(wěn)定整合，使之經(jīng)過各

25、種發(fā)育途徑得到能把外源目的基因傳給子代的個體。應用 ：（1）在基因表達調(diào)控研究方面的應用：利用轉(zhuǎn)基因動物可作為在體內(nèi)研究外源基因表達調(diào)控的“反應器”；（2）用于基因產(chǎn)品的制備：把轉(zhuǎn)基因動物看作是一種個體表達系統(tǒng)，使導入的目的基因表達，人們就可以從該動物的乳汁和血液里獲得目的基因產(chǎn)物。21. 基因敲除的基本程序？答：通過DNA同源重組，使特定的內(nèi)源基因被破壞而造成功能喪失，然后通過介導得到該基因喪失的生物模型的過程。 以小鼠的某基因敲除為例：1、靶載體的同源序列要足夠長，要含有篩選用的標志基因；2、胚胎干細胞的體外培養(yǎng)；3、靶載體導入胚胎干細胞；4、同源重組胚胎干細胞的篩選；5、基因敲除胚胎干細

26、胞注射入胚泡；6、胚泡植入假孕小鼠的子宮中；7、雜交育種獲得純合的基因敲除動物。22對天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？答：天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對之進行改造構(gòu)建：1、加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇，通常是抗生素基因。 2、增加或減少合適的酶切位點，便于重組。3、縮短長度，切去不必要的片段，提高導入效率，增加裝載量。4、改變復制子情況，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝。5、根據(jù)特殊需求加裝特殊的基因元件。23. 利用雙脫氧末端終止法（Sanger法）測定DNA一級結(jié)構(gòu)的原理與方法？答：采用2，3-雙脫氧核苷酸，由于它缺少形成3，5磷酸二脂

27、鍵所需要的3-OH,一旦參入到DNA鏈中，此DNA鏈就不能進一步延長。根據(jù)堿基配對原則，每當DNA聚合酶需要dNMP參入到正常延長的DNA鏈中時，就有兩種可能性，一是參入ddNTP,結(jié)果導致脫氧核苷酸鏈延長的終止，二是參入dNTP,使DNA鏈仍可繼續(xù)延長直至參入下一個ddNTP。根據(jù)這一方法，就可得到一組以ddNTP結(jié)尾的長短不一的DNA片段。反應終止后，分四個泳道進行電泳，以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個堿基)。再根據(jù)片段3端的雙脫氧堿基的情況，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。24. 典型的DNA重組實驗通常包括哪些步驟？答：外源基因的獲得。如酶切法、反轉(zhuǎn)錄法人工合成法；載體的獲得。如質(zhì)粒、噬菌體；獲得重組體；重組體導入受體細胞核。轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、雜交、細胞融合、顯微注射技術(shù)；對吸收重組DNA的細胞進行篩選鑒定；對含有重組DNA細胞進行大量培養(yǎng)，檢測外源基因是否表達。25.提出一個將真核細胞中的mRNA與其他類型的RNA分開的方法。答：真核細胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有3端的Poly(A)尾巴。A與dT可