分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)精

1、分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)生物技術(shù)教學(xué)室編寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2008年8月實驗一 分子生物學(xué)實驗技術(shù)多媒體演示目的要求通過多媒體試驗錄像進(jìn)一步掌握分子生物學(xué)基本操作技術(shù)。教學(xué)方式多媒體光盤演示。實驗內(nèi)容基本的分子生物學(xué)實驗操作技術(shù)包括核酸凝膠電泳技術(shù)；質(zhì)粒提??；轉(zhuǎn)化；重組體的篩選；PCR技術(shù)等。實驗二 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA目的要求 通過本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)實驗原理 瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同

2、數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50 kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場中，pH8.0條件下，凝膠中帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移。 瓊脂糖凝膠有如下特點： (1) DNA的分子大小 在凝膠基質(zhì)中其遷移速率與堿基對數(shù)目的常用對數(shù)值成反比，分子越大遷移得越慢。 (2) 瓊脂糖濃度 一個特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對數(shù)與凝膠濃度(t)成線性關(guān)系。

3、 (3) 電壓 低電壓時，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。 (4) 電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對遷移速率在4與30之間不發(fā)生明顯改變，但濃度低于0.5%的凝膠或低熔點凝膠較為脆弱，最好在4條件下電泳。 (5) 嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的堿基對間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更

4、強,還會使線狀遷移率降低15%。 (6) 離子強度 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化。 對于天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配制成濃縮母液，室溫保存，用時稀釋。實驗儀器與設(shè)備 1. 恒溫培養(yǎng)箱 2. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 3. 高壓滅菌鍋 4. 紫外線透射儀實驗材料 1.三羥甲基氨基甲烷（Tris） 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚藍(lán) 5.蔗糖 6.瓊脂糖 7.溴化乙錠

5、 8.DNA marker 9.DNA樣品實驗步驟1.緩沖液的配制 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液) 配1000mL 5×TBE: Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20mL Ph8.0 凝膠加樣緩沖液(6×)溴酚藍(lán) 0.25%蔗糖 40%溴化乙錠溶液(EB) 0.5g/mL2.制備瓊脂糖凝膠 按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚?瓊脂糖凝膠濃度 線性DNA的有效分離范圍 0.3% 5-60 kb 0.6% 1-20 kb 0.7% 0.8-10 kb 0.9% 0.5-7 kb 1.2% 0.4-6 kb

6、 1.5% 0.2-4 kb 2.0% 0.1-3 kb3.膠板的制備 (1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、干燥的玻璃板的邊緣（或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口）封住，形成一個膠膜（將膠膜放在工作臺的水平位置上，用水平儀校正）。 (2) 配制足夠用于灌滿電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液（1×TBE）。準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在電泳槽和凝膠中務(wù)必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強度或pH值的微小差異會在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA片段的遷移率 。 (3) 在錐瓶的瓶頸上松松地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱至瓊脂糖

7、溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過長時間，溶液將過熱并暴沸。應(yīng)核對溶液的體積在煮沸過程中是否由于蒸發(fā)而減少，必要時用緩沖液補充。 (4) 使溶液冷卻至60。加入溴化乙錠（用水配制成10mg/mL的貯存液）到終濃度為0.5ug/mL，充分混勻。 (5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固后，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時孔底將有破裂的危險，破裂后會使樣品從玻璃板之間滲透。 (6)將剩余的溫?zé)岘傊侨芤旱谷肽z模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。 (7)在凝膠完全凝

8、固后（于室溫放置30-45分鐘） ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入電泳槽中。 低熔點瓊脂糖凝膠及濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠應(yīng)冷卻至4，并在冷庫中電泳。 (8)加入恰好沒過膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。4加樣 DNA樣品與所需加樣緩沖液混合后，用移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。此時凝膠已浸沒在緩沖液中。每個孔的最大加樣量，依據(jù)DNA的數(shù)量及大小而定，一般為20-30L樣品。已知大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)同時加在凝膠的左凝膠的左側(cè)和右側(cè)孔內(nèi)。確定未知DNA的大小。測量未知DNA的大小時，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。5電泳 在低電壓條件下,線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關(guān)系,但是,

9、在電場增加時,不同相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速率不同。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不應(yīng)高于5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑移到距離膠板下沿約1-2cm處，停止電泳。作業(yè) 1 在波長為254nm的紫外燈下,觀察染色后的電泳凝膠。2 采用透射紫外光拍照，照相機鏡頭加近攝光圈和紅色濾光片（580-600n m）,距離50-60cm。采用全色膠卷，5.6光圈,10-20S。（或采用凝膠成像系統(tǒng)，將圖片以文件的形式保存） 實驗三 DNA的粗提取與鑒定目的要求 學(xué)會DNA的粗提取和鑒定的方法，觀察提取出來的DNA物質(zhì)。實驗原理 DNA

10、在氯化鈉溶液中的溶解度，是隨著氯化鈉的濃度變化而改變的。當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0.14mol/L時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。 DNA遇二苯胺（沸水?。境伤{(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。實驗儀器與設(shè)備 1. 鐵架臺 2. 玻璃棒(1個) 3. 濾紙 4. 量筒（100mL，1個） 5. 燒杯(100mL 1個, 50mL和500mL各2個 ) 6. 試管（20mL，2個） 7. 漏斗(1個) 8. 試管夾(2個) 9.

11、 紗布(15塊) 10.離心機(1臺)實驗材料 1. 雞血細(xì)胞液（5mL10mL） 2. 95%乙醇（預(yù)冷24h） 3. 蒸餾水 4. 檸檬酸鈉(質(zhì)量濃度0.1g/mL) 5. 氯化鈉(2mol/L和0.015mol/L) 6. 二苯胺 7. 高氯酸 8.乙醛 9. 冰乙酸實驗步驟 實驗前需要制備雞血溶液，制備的方法是：取檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為0.1g/mL的溶液（抗凝劑）100mL，置于500mL燒杯中。將宰殺活雞流出的雞血（約180mL）注入燒杯中，同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合，以免凝血。然后，將血液倒入離心管內(nèi)，用1000rpm離心2min，此時血細(xì)胞沉淀于離心管底部。實

12、驗時，用吸管除去離心管上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液（如果沒有離心機，可以將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，靜置一天，使血細(xì)胞自行沉淀）。1 提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì) 將制備好的雞血細(xì)胞液5mL10mL，注入到50mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20mL，同時用玻璃棒充分?jǐn)嚢?min，使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過濾至500mL的燒杯中，取其濾液。2 溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA 將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L的溶液40mL加入到濾液中，并搖動燒杯，使其混合均勻，這時DNA載溶液中呈溶解狀態(tài)。3 析出含DNA的粘稠物 沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時燒杯

13、中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會越來越多。當(dāng)粘稠物不再增加時停止加入蒸餾水（這時溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量的濃度相當(dāng)于0.14mol/L）。4 濾取含DNA的粘稠物 用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至500mL的燒杯中，含DNA的粘稠物被留在紗布上。5 將DNA的粘稠物再溶解 取1個50mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L的溶液20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃棒不停地攪拌，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中。6 過濾含有DNA的氯化鈉溶液 取1個100mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。

14、取其濾液，DNA溶于濾液中。7 提取含雜質(zhì)較少的DNA 在上述濾過的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為95%的溶液50mL（使用冷卻的酒精，對DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會出現(xiàn)含有雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA。注意觀察絲狀物是什么顏色。8 DNA的鑒定 取兩支20mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0.015mol/L的溶液5mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管

15、中溶液顏色的變化。將觀察的結(jié)果填寫在實驗報告冊上。作業(yè) 1.步驟8的2支試管中溶液顏色的變化說明了什么?將得出的結(jié)論填寫在實驗報告冊上。2提取雞血中的DNA時,為什么要除去血液中的上清液?3. 步驟1和步驟3中都需要加入蒸餾水,兩次加入的作用相同嗎?為什么?實驗四 質(zhì)粒DNA的制備實驗?zāi)康?通過本實驗，學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。實驗原理 堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.012.5這個狹窄的范圍內(nèi),線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊

16、密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)PH至中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，在而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。實驗儀器與設(shè)備 1.恒溫培養(yǎng)箱 2.恒溫?fù)u床3.臺式離心機(最大轉(zhuǎn)速4000rpm) 4.冷凍高速離心機5.高壓滅菌鍋 6.超凈工作臺7.微量移液器 8.eppendorf tub、tip實驗材料1.葡萄糖 2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氫

17、氧化鈉5.十二烷基硫酸鈉(SDS) 6.乙酸鉀7.冰乙酸 8.氯仿9.乙醇 10.胰RNA酶11.氨芐青霉素 12.蔗糖13.溴酚藍(lán) 14.酚15.巰基乙醇 16.鹽酸17.含pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌 附：試劑的配制1.溶液50mmol/L 葡萄糖5mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2.溶液0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等體積混合3.溶液5mmol/L 乙酸鉀 60 mL冰乙酸 11.5 mL水 28.5 mL4.TE緩沖液10mmol/L Tris· HC

18、l1 mmol/L EDTA(pH8.0)5.70%乙醇(放-20冰箱中,用后即放回)6.胰RNA酶 將RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的濃度，于100 加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存于-20 。7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴藍(lán)酚8.酚實驗步驟(一) 提取質(zhì)粒1將2mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入含質(zhì)粒的大腸桿菌，37振蕩培養(yǎng)過夜。 2取1.5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中，4000rpm，離心2min。 3吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。4將細(xì)菌沉淀懸浮于100L溶液中，充分混

19、勻，室溫放置10 min。5加200L溶液（新鮮配制），混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上5 min。6加入150L溶液（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。71200rpm，離心15 min，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。8向上清中加入等體積酚：氯仿(去蛋白)，反復(fù)混勻，12000rpm，離心5min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中.9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻后,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。10用1mL70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。11加50L TE緩沖液，其中含有20g/mL的胰RNA

20、酶，使DNA完全溶解，-20保存。（二）瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA方法參見實驗二作業(yè)1. 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 的原理是什么？2. 用凝膠成像系統(tǒng)拍照質(zhì)粒DNA電泳圖，并分析電泳所得條帶實驗五 PCR法制備目的DNA實驗?zāi)康?通過本實驗學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。實驗原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在待擴增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。1變性：加熱使模板DNA在高溫下（94）變性，雙鏈間的氫斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。2退火：使溶

21、液溫度降至50-60，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)全，即退火階段。3延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5´3´方向復(fù)制出互補DNA，即引物的延伸階段。上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25-30個循環(huán)后DNA可擴增106-109倍。典型的RCP反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶

22、。實驗儀器與設(shè)備 1PCR基因擴增儀 2瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)實驗材料1. DNA模板 2. 4種dNTP3. 引物1和引物2 4. Taq酶5. 瓊脂糖 6. DNA Marker7. tip 8.eppendorf管9. 微量移液器附試劑的配制： 1. 10×PCR緩沖液 500mmol/L KCl 100mmol/L Tris· HCl (PH8.3，室溫) 15mmol/L MgCl2 0.1% 明膠 2. 4×dNTP 10mmol/L dATP 10mmol/L dCTP 10mmol/L dGTP 10mmol/L dTTP3. Taq酶 1u/L4.

23、DNA模板 1ng/L5. 引物溶液濃度 10pmol/L實驗步驟1在0.5mL Eppendorf管內(nèi)配制25L反應(yīng)體系 反應(yīng)物 體積/L ddH2O 11 10×PCR緩沖液 2.5 2.5mmol/L dNTP 2.0 25mmol/L MgCl2 1.5 引物1 1.0 引物2 1.0 模板DNA 5 Taq酶 1 混勻,加25L石蠟油.2.按下述程序進(jìn)行擴增 94預(yù)變性 5min 94變性 1min 52退火 30 sec 72延伸 30 sec 重復(fù)步驟- 30次 72終延伸 10min 3瓊脂糖凝膠電泳分析RCR結(jié)果配制1.5%瓊脂糖凝膠，取10L擴增產(chǎn)物電泳。保持電流

24、40mA.電泳結(jié)束后，用EB染色15min,紫外燈下觀察結(jié)果。作業(yè) 根據(jù)紫外燈下觀察的結(jié)果，畫出電泳示意圖，并討論PCR反應(yīng)的注意事項。實驗六 限制性內(nèi)切核酸酶消化反應(yīng)實驗?zāi)康?通過本實驗學(xué)習(xí)DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。實驗原理1.限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA 序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:類和類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。類酶結(jié)合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠(yuǎn)處的DNA，而類酶在識別位點上切割DNA 分子,然后從底物上解離。類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核

25、酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。絕大多數(shù)類限制酶識別長度為4 至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoR識別六個核苷酸序列:5'- GAATTC-3'),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCCGGG-3');有的切割位點在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA 片段稱粘性未端, 如EcoR切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。 5'GAATTC3' 5'G AATTC3' ；3

26、'CTTAAG 5' 3'CTTAA G5' 2.DNA 純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA 或單鏈DNA 的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時,會影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L

27、NaAc 和2倍體積無水乙醇，混勻后置于-70低溫冰箱內(nèi)30 分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個酶切反應(yīng)。 3.DNA 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA 的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。構(gòu)建DNA 限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA 用量約為0.5-1g。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其

28、相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37)。對質(zhì)粒DNA 酶切反應(yīng)而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1g DNA 加1 單位酶，消化1-2 小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。實驗儀器與設(shè)備 水平式電泳裝置，電泳儀，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，微量移液器，微波爐，紫外透射儀，照相系統(tǒng)實驗材料DNA; 重組pUC19 質(zhì)粒; EcoR I 酶及其酶切緩沖液; Hind 酶及其酶切緩沖液;瓊脂糖(Agarose)。 附試劑的配制： 1、 5×TBE 電泳緩沖液：見實驗二。 2、 6×加樣緩沖液：見實驗二。3、 溴化乙錠

29、：見實驗二。實驗步驟1.將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf 管編號，用微量移液槍分別加入1g DNA 和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，10×緩沖液2L，再加入重蒸水使總體積為19L，將管內(nèi)溶液混勻后加入1L 酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。2. 混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf 管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7水浴保溫2-3 小時，使酶切反應(yīng)完全。 3.每管加入2L 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻,以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?.制備瓊脂糖凝膠分析內(nèi)切酶酶切反應(yīng)結(jié)果配制1.5%瓊脂糖凝膠，取10L 酶解液與2L 6×加樣液混勻電泳。保持電壓在60-80V，電流在40mA.電泳結(jié)束后，用EB染色20-25min，紫外燈下觀察結(jié)果。作業(yè) 根據(jù)紫外燈下觀察的結(jié)果，畫出電泳示意圖，并討論內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的注意事項。實驗七 E. coli感受態(tài)細(xì)胞的制備實驗七八 DNA連接、轉(zhuǎn)化及重組鑒定實驗?zāi)康?通過本實驗，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)實驗原理 細(xì)菌處于容易吸收外源DNA 的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹