腸道病毒的分類與檢測(cè)

1、腸道病毒的分類與檢測(cè)摘 要 腸道病毒可引發(fā)多種感染，并且發(fā)病以綜合癥出現(xiàn)，一種綜合癥可有不同病毒所引起，同一種病毒可以導(dǎo)致不同綜合癥是腸道病毒感染的普遍現(xiàn)象。目前除脊髓灰質(zhì)炎外，尚無疫苗可供預(yù)防，是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康的重要病原之一。腸道病毒主要經(jīng)糞一口或呼吸道傳播，所以對(duì)腸道病毒感染作出準(zhǔn)確、及時(shí)的診斷是非常必要的。腸道病毒（Enterovirus）是小RNA病毒科，有67個(gè)血清型。人類腸道病毒包括：脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）、柯薩奇病毒（Coxsackievirus）、?？刹《荆‥cho）、甲型肝炎病毒以及新型病毒。目前常用的檢測(cè)腸道病毒的方法有病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)鑒定、分子生

2、物學(xué)方法，近年來，一些新型方法也使得腸道病毒的檢測(cè)快速化與準(zhǔn)確化。關(guān)鍵詞 腸道病毒/診斷/分類1 腸道病毒形態(tài)特點(diǎn) 腸道病毒是球形、無包膜、核衣殼20面體立體對(duì)稱。腸病毒屬病毒粒子在酸性pH下穩(wěn)定，在病毒制品中可觀察到空衣殼，有時(shí)可觀察到少量（1%）的重顆粒?；蚪M編碼單一的VPg蛋白，但不編碼L蛋白。不同腸道病毒及腸道病毒與鼻病毒間整個(gè)核苷酸序列一致性大于50%，一種腸道病毒不同株之間整個(gè)核苷酸序列的一致性大于75%。病毒主要在腸道細(xì)胞中復(fù)制，也能在神經(jīng)、肌肉和其它一些組織中復(fù)制。大多數(shù)病毒感染無明顯癥狀，病毒感染的臨床癥狀包括輕微腦膜炎、腦炎、肌炎、心肌炎和結(jié)締組織炎。耐酸和脂溶劑，不易被

3、胃酸和膽汁滅活，在污水和糞便中活數(shù)月。2 腸道病毒的分類2.1 脊髓灰質(zhì)炎病毒此病癥的典型臨床經(jīng)過六個(gè)階段（潛伏期、前驅(qū)期、癱瘓前期、癱瘓期、恢復(fù)期和殘留麻痹）。感染期間患者表現(xiàn)為低熱及咽痛、咳嗽、腹瀉、不安、嗜睡、多汗、腦膜刺激癥、肌肉疼痛、皮膚感覺過敏，突發(fā)急性弛緩性麻痹等癥狀，最后多遺留下終生殘疾。脊髓灰質(zhì)炎病毒通過患者的糞便或口腔分泌物傳染。人類是脊髓灰質(zhì)炎病毒的唯一宿主，長(zhǎng)期攜帶病毒的情況（例如無癥狀，但仍持續(xù)排出病毒長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月以上）很罕見。服用脊髓灰質(zhì)炎疫苗（現(xiàn)在我國使用I、II、III型混合糖丸疫苗，是由減毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒制成的）是預(yù)防本病的主要措施。消滅脊髓灰質(zhì)炎最根本的手段

4、是提高人群免疫水平，斷絕脊髓灰質(zhì)炎野毒株在人群中的傳播。脊髓灰質(zhì)炎病毒分為三個(gè)血清型；兩種不同抗原：D抗原和C抗原。D（dense，致密）抗原：具有病毒RNA，為完整的病毒顆粒，又稱N（native）抗原；C（coreless，無核心）抗原：不含RNA，是D顆粒經(jīng)56 滅活，RNA釋放后形成的無核酸空心衣殼，故又稱H（heated）抗原；不同型別病毒C抗原可發(fā)生交叉反應(yīng)，但D抗原無交叉反應(yīng)；傳播方式主要是糞-口傳播，所致疾病是脊髓灰質(zhì)炎。中毒機(jī)理：糞口途徑傳播為主上呼吸道，咽喉，腸道為侵入門戶先在局部粘膜和淋巴結(jié)中增殖入血，形成第一次病毒血癥帶有受體的靶組織（脊髓前角細(xì)胞、背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)

5、神經(jīng)細(xì)胞等）在靶細(xì)胞中再次增殖后形成第二次病毒血癥及臨床癥狀。檢測(cè)方法第一是微生物學(xué)檢查，檢測(cè)方法：病毒分離檢查：取咽漱液、糞便等樣本，細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)CPE；血清學(xué)診斷：中和試驗(yàn)；病毒核酸測(cè)定。第二是防治:口服減毒活疫苗或者注射滅活疫苗.2.2 柯薩奇病毒柯薩奇病毒2對(duì)乳鼠的敏感性很高，根據(jù)它們感染乳鼠產(chǎn)生的病灶，柯薩奇病毒可以分為a、b兩組。a組有23型病毒，b組有6型病毒。A組病毒：誘發(fā)新生乳鼠彌漫性骨胳肌炎，導(dǎo)致馳緩性麻痹。B組病毒：誘發(fā)新生乳鼠局灶性骨胳肌炎，導(dǎo)致痙攣性麻痹。通過型特異性抗原，經(jīng)中和試驗(yàn)。Elisa方法等可以對(duì)各型進(jìn)行鑒定。所有的b組及a組的第9型有共同的組特異性抗原，在

6、b組內(nèi)病毒之間有交叉反應(yīng)，但是a組病毒沒有共同的組特異性抗原。a組某些型別的型特異性抗原可在37引起人類O型紅細(xì)胞凝集反應(yīng)。柯薩奇病毒A型感染潛伏期1-3天，上呼吸道感染，起病急，流涕、咳嗽、咽痛、發(fā)燒，全身不適。典型癥狀為皰疹性咽峽炎，即在鼻咽部、會(huì)厭、舌和軟腭部出現(xiàn)小皰疹，粘膜紅腫，淋巴濾泡增生、滲出，扁桃體腫大，伴吞咽困難，食欲下降。據(jù)調(diào)查（R0binson，1958）伴有口咽部皰疹和皮疹的急性熱病中，79%為柯薩克A型病毒所致。檢測(cè)方法：1.病人體液（腦脊液、皰疹液、心包液、胸水等）分離出病毒即可確診。）2恢復(fù)期血清出現(xiàn)抗體，或雙份血清抗體效價(jià)增高4倍以上。2.3 ?？刹《景？刹《?E

7、CHO)（ECHO-viruses）病毒即腸性細(xì)胞致病性人類孤獨(dú)型病毒（enteric cytopatho-genic human orphan virus）。只對(duì)人類有感染性，多發(fā)于夏、秋季，絕大多數(shù)是隱性感染。ECHO病毒分為30多個(gè)型（1-34型，其中8、10、28、34型已歸入其他病毒）。各型致病力和致病類型也不同，如ECHO6、19型致病力較強(qiáng)，它類似于柯薩奇病毒B型引起急性胸痛和心肌病。主要經(jīng)口-糞途徑傳播，也可通過咽喉分泌物排除病毒經(jīng)呼吸道傳播。病毒進(jìn)入人體在咽部機(jī)腸粘膜細(xì)胞增殖后，侵入血流，形成病毒血癥。ECHO病毒感染的臨床表現(xiàn)類似于風(fēng)疹，第一孕季感染雖可累及胎兒，但很少引起

8、畸形。發(fā)病年齡2.533歲，常見的癥狀為上呼吸道感染、發(fā)燒、非化膿性腦膜炎和皮疹。皮疹為斑丘疹或麻疹樣皮疹，持續(xù)13天自然消退。可從大便、咽分泌物和腦脊液中分離出病毒。防治：?？刹《菊钌袩o特殊療法。皮疹對(duì)癥處理。對(duì)易感的嬰幼兒可注射丙球蛋白36ml，脊髓灰質(zhì)炎減毒疫苗可干擾本病毒的感染。ECHO-3，4，6，9，11型減毒活疫苗正在研制中。目前尚未有特效治療，主要采用對(duì)癥和支持療法。靜脈注射人血丙種球蛋白對(duì)新生兒嚴(yán)重感染可能有效，嬰幼兒腹瀉也有導(dǎo)致脫水及酸中毒的可能，須酌情給予輸液治療。2.4 甲型肝炎病毒臨床上表現(xiàn)為急性起病，主要表現(xiàn)為乏力、食欲減退、及肝功能異常，部分病例可出現(xiàn)黃疸。甲型肝

9、炎病毒主要通過糞口途徑傳播，傳染源多為病人。甲型肝炎的潛伏期為15-45天，病毒常在患者轉(zhuǎn)氨酸升高前的5-6天就存在與患者的血液和糞便中。發(fā)病2-3周后，隨著血清中特異性抗體的產(chǎn)生，血液和糞便的傳染性也隨之消失。從感染者的糞便中排出，通過不同的途徑污染了食物和用具，又經(jīng)過口侵入人體。這就是甲肝病毒的傳播方式。2.5 新型病毒新型病毒指在1969年以后鑒定的除脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒以外的幾種小RNA病毒，主要包括68-71共四個(gè)血清型。其中68型分離自下呼吸道感染者，69型分離自健康人肛門拭子，70型分離自急性出血性結(jié)膜炎患者，71型分離自無菌性腦膜炎患者的糞便和腦脊液。EV70主

10、要引起流行性出血性結(jié)膜炎；EV71感染主要引起手足口病，還可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。3 檢測(cè)方法3.1 病毒分離培養(yǎng) 利用組織培養(yǎng)技術(shù)從感染部位或傳染源分離出病毒并鑒定其特異性血清型是病毒性疾病診斷的標(biāo)準(zhǔn)。病人標(biāo)本是最常采集的標(biāo)本。病毒培養(yǎng)對(duì)縮短抗生素治療和住院期有積極作用，但是病毒的分離鑒定繁瑣、費(fèi)力、耗時(shí)，一般一周才能觀察到細(xì)胞病理反應(yīng)，而且許多腸道病毒不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，或者可以培養(yǎng)但不出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)。3.2 血清學(xué)鑒定2分離病毒和利用組合血清中和試驗(yàn)是對(duì)病毒定型的重要方法。腸道病毒的血清學(xué)鑒定中，多選用組合血清。此方法檢測(cè)中不適用于早期診斷，可作為回顧性診

11、斷；且由于腸道病毒血清型眾多，臨床使用檢測(cè)價(jià)值有限，而多為流行病學(xué)采用。3.3 分子生物學(xué)診斷3.3.1 PCR技術(shù)由于各型病毒具有共同基因組序列，也可檢出幾乎所有血清型。PCR檢測(cè)材料用量少、快速、靈敏度高且具有特異性，并可通過設(shè)計(jì)不同的引物進(jìn)行病毒分型，用于檢測(cè)相當(dāng)寬的腸道病毒血清型。盧亦愚3等人發(fā)明了用腸道病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，靈敏度高，非常適用于如手足口病等有腸道病毒感染引起突發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室早期診斷，該方法具有高特異性。3.3.2 核酸雜交技術(shù)4由于EV各型間存在序列高度保守區(qū)，利用針對(duì)此保守區(qū)的通用互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)核酸探針可進(jìn)行大范圍的EV診斷

12、。3.3 其他新型方法2000年，Notomi 等開發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法， 即所謂環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法。5該方法利用一種鏈置換DNA 聚合(BstDNApolymerase)和兩對(duì)特殊的引物，特異地識(shí)別靶序列上的6 個(gè)獨(dú)立區(qū)域，使反應(yīng)在模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，從而保證引物可以在等溫條件下(65左右)與模板結(jié)合并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。 RT-LAMP 檢測(cè)方法在滿足特異性同時(shí)，靈敏度可達(dá)到普通RT-PCR 法的10-100 倍，或熒光RT-PCR 法的1/10 或與之在同一水平。優(yōu)點(diǎn)：（1）高特異性 （2）高靈敏度 （3）鑒定簡(jiǎn)便 （4）操作簡(jiǎn)單 （5）快速、高效：整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)只需1-1.5小時(shí)5。參考文獻(xiàn) 1 騰崢，張曦 上海市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)室 腸道病毒的檢測(cè)方法及評(píng)價(jià)2 張素