脂肪鑒定 脂類細胞化學(蘇丹Ⅲ染色法) 實驗報告

1、細胞生物學實驗報告脂類細胞化學（蘇丹染色法）1. 實驗?zāi)康模河锰K丹染液對小鼠的腸系膜細胞染色，觀察細胞顏色，掌握蘇丹染液的染色方法。2. 實驗用品：（1） 儀器及器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、手術(shù)剪、解剖盤、膠頭滴管（2） 實驗藥品：蒸餾水、甲醛鈣溶液、70%乙醇水溶液、蘇丹染液（3） 實驗材料：小鼠3. 實驗原理：（1） 由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物統(tǒng)稱為脂類，這是一類一般不溶于水而溶于脂溶性溶劑的化合物。脂類是機體內(nèi)的一類有機大分子物質(zhì)，它包括范圍很廣，大體上可以分為類脂和油脂兩大類。類脂包括磷脂(phospholipids)，糖脂(glycolipid)和膽固醇及其酯(cho

2、lesterol and cholesterol ester)三類。而油脂可以分為常溫下常溫液態(tài)的油和常溫下固態(tài)的脂肪兩類。這幾種脂類化學結(jié)構(gòu)有很大差異，生理功能各不相同。其共同物理性質(zhì)是不溶于水而溶于有機溶劑，在水中可相互聚集形成內(nèi)部疏水的聚集體。（2） 在固定細胞時，通常使用脂溶性固定液。然而，鑒定的材料是脂肪時，脂溶性的固定液會溶解脂肪，致使把切片放到顯微鏡下觀察時，觀察不到被染色的脂肪，只能看到脂肪細胞中有很大的空洞。最好的固定材料是甲醛類的固定液。如醫(yī)學上保存尸體采用的是福爾馬林，即40%的甲醛水溶液，本次實驗采用的則是甲醛鈣溶液。（3） 光學顯微鏡的切片多是石蠟切片。在熔接石蠟時，

3、需要用到脂溶性溶劑，而脂溶性溶劑會溶解細胞中的脂肪，因此本次實驗不可采用石蠟切片。但是鋨酸固定的脂肪不溶于無水乙醇、二甲苯等有機溶劑，可以采用石蠟切片。（4） 制作切片有多種方法，如冰凍切片、明膠包埋冰凍切片、本次實驗采用的是操作簡單的鋪片法。（5） 脂類染色的原理是，染料溶于脂類顯色。選擇溶劑時應(yīng)注意，溶劑必須既溶解的染料，又不溶解掉脂類。4. 實驗步驟：（1） 用斷頭法處死小鼠，置于解剖盤中。剪開腹腔，用鑷子提起小腸，使蓋玻片緊貼于腸系膜。用剪子將連同蓋玻片和其上粘的腸系膜剪下，反扣于已滴加甲醛鈣的載玻片上，固定15分鐘,（2） 吸蒸餾水滴于載玻片、載玻片之間沖洗，用滴管不斷吸取液體以去除

4、固定液。（3） 用70%的乙醇水溶液代替蒸餾水重復(fù)上一步驟，進行沖洗。（4） 用蘇丹染液染色30mins。（5） 染色結(jié)束時，用吸水紙吸去多余染液。擦凈蓋玻片周邊及表面，用顯微鏡觀察。5. 實驗結(jié)果：脂肪細胞被蘇丹染液染成橘紅色。細胞周圍有溢出的脂肪粒，呈圓形，橘紅色。10*4顯微鏡下觀察：10*10顯微鏡下觀察：10*40顯微鏡下觀察：6. 分析與討論（1） 結(jié)果分析：脂肪細胞中含有大量脂肪，脂肪被蘇丹染液染成橘紅色，因而使整個細胞呈現(xiàn)橘紅色。某些脂肪細胞破裂，而使脂肪溢出，呈橘紅色的圓球狀。（2） 注意事項 在用蓋玻片貼腸系膜：由于小鼠的腸系膜很小，因而應(yīng)該提前縮小蓋玻片的尺寸?？梢杂眉舻?/p>

5、剪或用手掰小，并盡量使最后的蓋玻片呈正方形。 腸系膜的選擇：腸系膜是一層包裹在小腸外的很細的薄膜，這層膜的大部分地方是沒有脂肪細胞的。但是，腸系膜血管的周圍有一些起保護作用的脂肪細胞。因此，選材時應(yīng)注意選擇含有血管的腸系膜。但是有一些血管周圍的脂肪細胞非常厚，肉眼可見呈白色。這樣的地方是無法觀察的，所以選材時還要注意材料的透明度。 染色：染色過程為30mins，在這一過程中，染料中的水分很有可能蒸發(fā)，因此在染色過程中應(yīng)不時向載玻片中滴加染料。 觀察：在把物鏡由10倍轉(zhuǎn)為40倍時，應(yīng)考慮到物鏡變長，可能會使鏡面蹭到小鼠的小腸。在觀察時可先將小腸切除，只觀察腸系膜。 觀察：觀察時如果血管呈紅色，是

6、由于放血時沒有放干凈，下次實驗應(yīng)該注意（3） 作業(yè)：糖類的鑒定Molisch反應(yīng)（- 萘酚反應(yīng)）：此方法是鑒定糖類最常用的顏色反應(yīng)。它的原理是：糖類在濃酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以與- 萘酚作用，形成紅紫色復(fù)合物。由于在糖溶液與濃硫酸兩液面間出現(xiàn)紅紫色的環(huán)，因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比較穩(wěn)定，其靈敏度與- 萘酚一樣。除了糖類之外，各種糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈現(xiàn)近似的陽性反應(yīng)。因此，陰性反應(yīng)證明沒有糖類物質(zhì)的存在；而陽性反應(yīng)只能說明有糖類存在的可能。此反應(yīng)不能鑒別多聚糖如淀粉，纖維素等。Benedict反應(yīng)：班氏試

7、劑是斐林試劑的改良（也是含有Cu2+的堿性溶液），能使具有自由醛基或酮基的糖類氧化，其本身則變成磚紅色或黃色的Cu2O，可用來測定還原糖的存在。它利用檸檬酸作為Cu2+的絡(luò)合劑，其堿性比斐林試劑弱，靈敏度高，干擾因素少，因而在實際應(yīng)用中有更多的優(yōu)點。Bial反應(yīng)（甲基間苯二酚反應(yīng)）：戊糖與濃鹽酸加熱形成糠醛，在有Fe3+存在的條件下，它與甲基間苯二酚（地衣酚）縮合，形成深藍色的沉淀物（此沉淀物溶于正丁醇）。己糖也能發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生灰綠色甚至棕色的沉淀物。Molisch反應(yīng)（- 萘酚反應(yīng)）： 此方法是鑒定糖類最常用的顏色反應(yīng)。它的原理是：糖類在濃酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以與- 萘酚作用，形

8、成紅紫色復(fù)合物。由于在糖溶液與濃硫酸兩液面間出現(xiàn)紅紫色的環(huán)，因此又稱紫環(huán)反應(yīng)。- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比較穩(wěn)定，其靈敏度與- 萘酚一樣。除了糖類之外，各種糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈現(xiàn)近似的陽性反應(yīng)。因此，陰性反應(yīng)證明沒有糖類物質(zhì)的存在；而陽性反應(yīng)只能說明有糖類存在的可能。Seliwanoff反應(yīng)：同樣的原理，將糖與濃酸作用后再與間苯二酚反應(yīng)，若是酮糖就顯鮮紅色，若是醛糖就顯淡紅色，由此可鑒別酮糖和醛糖。蒽酮反應(yīng)：糖類經(jīng)濃酸水解，脫水生成的糠醛及其衍生物與蒽酮（10-酮-9，10-二氫蒽）反應(yīng)生成藍綠色復(fù)合物。Barfoed test ： 檢驗單糖的一種試驗。將5ml的Barfoed試劑煮沸，在保持其沸騰情況下緩慢地加入待檢物。單糖還原比混合物，形成紅色沉淀物；而雙糖雖亦能還原，但反應(yīng)甚慢，可與前者區(qū)別。 脂肪的鑒