第七章-發(fā)酵染菌與防治

1、n防止發(fā)酵生產(chǎn)中雜菌污染有著重要的意義：1、保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量、收率的溫度2、保持發(fā)酵生產(chǎn)正常有序的進(jìn)行3、有利于節(jié)約型社會(huì)的建立一、發(fā)酵異常現(xiàn)象及染菌分析（一）種子培養(yǎng)基和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象1、種子培養(yǎng)基異常出現(xiàn)菌體生長(zhǎng)緩慢的原因是：1、種子自身的原因，菌種使用時(shí)間過(guò) 長(zhǎng)，傳代頻繁、菌體老化及接種量少2、培養(yǎng)基的原因：批次間原料成分波動(dòng)大。種子培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)缺乏3、操作過(guò)程中的原因，培養(yǎng)基滅菌不徹底、供氧不足等原因出現(xiàn)菌絲結(jié)團(tuán)的原因是：通氣不足、溶氧條件差、攪拌的剪切力力過(guò)大、培養(yǎng)基質(zhì)量下降等原因出現(xiàn)代謝不正常的原因是：培養(yǎng)環(huán)境差、接種量少、雜菌污染等原因2、發(fā)酵異常 1、菌體生長(zhǎng)差2、PH異常3、

2、溶解氧水平異常4、泡沫過(guò)多5、菌體濃度過(guò)高或過(guò)低n（二）染菌隱患檢查n發(fā)酵過(guò)程是否染菌應(yīng)以無(wú)菌試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)。無(wú)菌試驗(yàn)方法主要有：顯微鏡檢查法、肉湯培養(yǎng)法、平板培養(yǎng)法、發(fā)酵過(guò)程中的異常觀察法。n（三）發(fā)酵染菌原因n總結(jié)為發(fā)酵工藝流程中的各環(huán)節(jié)漏洞和發(fā)酵過(guò)程中管理不善兩方面。n各環(huán)節(jié)漏洞包括：1、培養(yǎng)基滅菌不徹底2、無(wú)菌空氣帶菌3、種子帶菌4、消泡劑帶菌5、工藝用水帶菌6、管道及附屬設(shè)備或罐體出現(xiàn)滲漏或死角7、泡沫逃溢8、批次發(fā)酵后清洗不徹底等n 發(fā)酵過(guò)程中管理不善：1、工人的培訓(xùn)不到位導(dǎo)致操作上的認(rèn)識(shí)2、發(fā)酵車間衛(wèi)生環(huán)境差3、設(shè)備未定期檢修4、管理制度不完善n（四）染菌原因分析n1、染菌雜菌

3、分析表7-5n2、發(fā)酵染菌的規(guī)模分析n大批量發(fā)酵罐染菌：n個(gè)別發(fā)酵染菌：大都是由于設(shè)備滲漏造成，應(yīng)仔細(xì)檢查閥門、罐體、管路是否清潔。n3、不同污染階段分析：1、染菌發(fā)生在種子培養(yǎng)階段，或稱種子培養(yǎng)期染菌2、在發(fā)酵過(guò)程中的初始階段發(fā)生染菌，或稱發(fā)酵前期染菌3、發(fā)酵后期染菌大部分由空氣過(guò)濾不徹底，中間補(bǔ)料染菌，設(shè)備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問(wèn)題引起。n（五）染菌隱患處理n 在正式發(fā)酵之前必須做到以下幾點(diǎn)：1、嚴(yán)格按照生產(chǎn)工藝要求的各項(xiàng)指標(biāo)、參數(shù)、條件進(jìn)行操作2、投產(chǎn)前進(jìn)行整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的無(wú)菌測(cè)試3、嚴(yán)格工人的管理，實(shí)行操作記錄制度4、加強(qiáng)在線加測(cè)的技術(shù)手段，各種生物傳感器、探頭要定期校正5、定期對(duì)設(shè)備進(jìn)

4、行檢修n二、染菌對(duì)發(fā)酵的影響n（一）染菌對(duì)不同發(fā)酵過(guò)程的影響n（二）雜菌的種類和性質(zhì)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響n（三）染菌發(fā)生的時(shí)間不同對(duì)發(fā)酵的影響：1、種子培養(yǎng)期染菌2、發(fā)酵前期染菌3、發(fā)酵中期染菌4、發(fā)酵后期染菌n（四）染菌程度對(duì)發(fā)酵的影響：染菌程度越大，發(fā)酵罐內(nèi)的雜菌量越多，對(duì)發(fā)酵的危害也就越大，如果染菌嚴(yán)重尤其是發(fā)酵的前期、中期，對(duì)發(fā)酵的影響是非常嚴(yán)重的。n三、染菌污染后的挽救和處理n（一）種子培養(yǎng)期染菌的處理：若發(fā)現(xiàn)種子罐被雜菌污染，應(yīng)立即停止向發(fā)酵罐內(nèi)在輸送種子，進(jìn)行滅菌后排放，然后對(duì)種子罐連接的物料管道、供氣管道進(jìn)行徹底的滅菌，與此同時(shí)，采用未受污染的正常種子接入發(fā)酵罐中，以保證生產(chǎn)的連續(xù)

5、性，如無(wú)備用的種子，則可以選擇一個(gè)適當(dāng)菌領(lǐng)的發(fā)酵罐中的發(fā)酵液作為種子，接入新鮮的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，從而保證生產(chǎn)的正常進(jìn)行。n（二）發(fā)酵前期染菌處理：1、發(fā)酵前期發(fā)生染菌后，如培養(yǎng)基中的碳、氮源含量還比較高時(shí)，終止發(fā)酵，將培養(yǎng)基加熱至規(guī)定溫度，重新進(jìn)行滅菌處理后，再接入種子進(jìn)行發(fā)酵2、如果此時(shí)染菌已造成較大的危害，培養(yǎng)基中的碳、氮源的消耗量已比較多，則可以放掉部分料液，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，重新進(jìn)行滅菌處理后，再接種進(jìn)行發(fā)酵3、也可采取降溫培養(yǎng)、調(diào)節(jié)PH、調(diào)整補(bǔ)料量、補(bǔ)加培養(yǎng)基等措施進(jìn)行處理n（三）發(fā)酵中后期染菌處理1、發(fā)酵中、后期染菌或發(fā)酵前期輕微染菌而發(fā)現(xiàn)較晚時(shí)，可以適當(dāng)加入殺菌劑或抗生素以及正

6、常的發(fā)酵液，以抑制雜菌的生長(zhǎng)速度，也可采取降低培養(yǎng)溫度、降低風(fēng)量、停止攪拌、少量補(bǔ)糖等措施，進(jìn)行處理2、如果發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)物代謝已到達(dá)一定水平，此時(shí)產(chǎn)品的含量若達(dá)一定值，只要明確是染菌也可放罐3、對(duì)沒(méi)有提取價(jià)值的發(fā)酵液，加熱后排放n（四）染菌后對(duì)設(shè)備的處理：必須放罐后進(jìn)行徹底清洗，空罐加熱滅菌至120以上、保持30min才能使用n四、污染的防治策略n（一）強(qiáng)化空氣處理過(guò)程：1、空氣凈化流程2、過(guò)濾介質(zhì)選擇3、過(guò)濾介質(zhì)的填裝4、空氣凈化系統(tǒng)的管理n（二）嚴(yán)格培養(yǎng)原料及設(shè)備的滅菌n1、原料預(yù)處理n原料除雜目的：為了清除谷物或水果原料中的土塊、石塊、掉落的鐵質(zhì)零件，以免使機(jī)械收到磨損，發(fā)生故障。影響后

7、面的發(fā)酵工序n粉碎的目的：為了增大原料的比表面積，減少固體的團(tuán)塊n浸泡的目的：為了使原料與水充分接觸，進(jìn)而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)便于菌體的利用n2、培養(yǎng)基的滅菌n滅菌要求：在保證殺滅雜菌的前提下，盡可能多的保留營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)n3、設(shè)備滅菌n一、實(shí)罐滅菌。應(yīng)該充分排凈發(fā)酵罐內(nèi)的冷空氣二、對(duì)設(shè)備死角的處理1、法蘭連接的死角2、渣滓在罐底用環(huán)式空氣分布所形成的死角3、不銹鋼襯里的死角4、接種管路的死角5、排氣管的死角6、不合理補(bǔ)料管配置造成的死角7、壓力表安裝不合理形成的死角n（三）定期檢測(cè)設(shè)備及管道n1、發(fā)酵設(shè)備的定期檢查：機(jī)械密封在發(fā)酵罐上得到廣泛的應(yīng)用n2、管道、閥門的定期檢查：使用最多的是截止閥，閥門分為公稱

8、級(jí)、低漏級(jí)、蒸汽級(jí)和原子級(jí)n（四）嚴(yán)格培養(yǎng)物的移接n1.無(wú)菌室n配合使用化學(xué)滅菌藥劑有：75%酒精、0.6%-0.1%漂白粉、0.5%高錳酸鉀等n無(wú)菌室無(wú)菌度的要求：把無(wú)菌培養(yǎng)皿平板打開(kāi)蓋子在無(wú)菌室內(nèi)放置30min，根據(jù)一般工廠的經(jīng)驗(yàn)，長(zhǎng)出的菌落在3個(gè)以下為好n2.滅菌鍋n注意：排氣管是否暢通，因?yàn)闇缇伒呐艢夤茌^小，易被鐵銹或瓶子破碎后的培養(yǎng)基等所堵塞n3、接種用具要求：1、新購(gòu)置的玻璃儀器的處理2、移種前的操作3、移種操作過(guò)程的要求n（五）預(yù)防噬菌體的危害n噬菌體是：原核生物的病毒、非常微小，其直徑為0.1微米n噬菌體繁殖過(guò)程一般分為五個(gè)階段：噬菌體吸附到寄主細(xì)胞上，噬菌體的頭部核酸通過(guò)尾

9、管注入到寄主細(xì)胞中，以寄主細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)為原料，復(fù)制合成噬菌體自身的部件，完成組裝，分泌酶水解細(xì)胞壁使細(xì)胞破裂。n1、癥狀：發(fā)酵液光密度不上升或回降；PH逐漸上升，氨利用停止、糖耗、溫升緩慢或停止，產(chǎn)生大量的泡沫，使發(fā)酵液呈黏膠狀n2、原因是環(huán)境污染為主。環(huán)境污染噬菌體是造成噬菌體感染的只要根源n3、防治：1、定期檢查噬菌體并采取有效措施消滅噬菌體2、檢查生產(chǎn)系統(tǒng)，消除各種不安全因素3、選育抗噬菌體菌株和輪換使用生產(chǎn)菌株n應(yīng)急挽救措施 1、加入少量藥物以阻止噬菌體吸附或抑制噬菌體蛋白質(zhì)合成及增殖2、當(dāng)生產(chǎn)進(jìn)行中污染了噬菌體時(shí)，可補(bǔ)入適量的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基或促使菌種生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子3、大量補(bǔ)接種子液或

10、重新接種抗性菌種培養(yǎng)液，以便繼續(xù)發(fā)酵至終點(diǎn)五五 食用菌及生物農(nóng)藥生產(chǎn)中應(yīng)注意的染菌問(wèn)題食用菌及生物農(nóng)藥生產(chǎn)中應(yīng)注意的染菌問(wèn)題1、食用菌生產(chǎn)中的染菌危害、食用菌生產(chǎn)中的染菌危害A細(xì)菌細(xì)菌n谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。染雜菌，但噬菌體威脅大。n肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，營(yíng)養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制菌生長(zhǎng)和合成營(yíng)養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制菌生長(zhǎng)和合成代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物。B. 霉菌霉菌nPenG：青霉素水解酶上升，：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，迅速破壞，發(fā)酵一無(wú)所獲

11、。發(fā)酵一無(wú)所獲。n檸檬酸：檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染，不易染菌，主要防止前期染菌。菌。C. 酵母菌酵母菌: 易污染細(xì)菌以及野生酵母菌易污染細(xì)菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：無(wú)論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，疫苗：無(wú)論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。都應(yīng)全部廢棄。（1）染菌對(duì)不同菌種發(fā)酵的影響染菌對(duì)不同菌種發(fā)酵的影響（2）染菌種類對(duì)發(fā)酵的影響染菌種類對(duì)發(fā)酵的影響n青霉素：怕染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌青霉素：怕染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌n鏈霉素：怕染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌鏈霉素：怕染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌n四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜

12、桿菌n檸檬酸：怕染青霉菌檸檬酸：怕染青霉菌n肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌n谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染（3）不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響）不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響n種子擴(kuò)大時(shí)期染菌種子擴(kuò)大時(shí)期染菌: :n發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期染菌：n發(fā)酵中期染菌：挽救困難，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，快處理發(fā)酵中期染菌：挽救困難，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，快處理 ，處理方，處理方法應(yīng)根據(jù)各種發(fā)酵的特點(diǎn)和具體情況來(lái)決定法應(yīng)根據(jù)各種發(fā)酵的特點(diǎn)和具體情況來(lái)決定 n抗生素發(fā)酵抗生素發(fā)酵 n檸檬酸發(fā)酵檸檬酸發(fā)酵 a. 污染細(xì)菌：加大通風(fēng)，加速產(chǎn)酸，調(diào)污染細(xì)菌：加大通風(fēng)，加速產(chǎn)酸，調(diào)pH3.0

13、，抑制，抑制細(xì)菌細(xì)菌 b. 污染酵母：加入污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；抑制酵母；通風(fēng)加大，加速產(chǎn)酸。通風(fēng)加大，加速產(chǎn)酸。 滅菌后棄去滅菌后棄去應(yīng)迅速重新滅菌，補(bǔ)充必要的營(yíng)養(yǎng)成分，重新接種應(yīng)迅速重新滅菌，補(bǔ)充必要的營(yíng)養(yǎng)成分，重新接種（3）不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響）不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響n檸檬酸發(fā)酵檸檬酸發(fā)酵c.染黃曲霉：加入另一罐將近發(fā)酵成熟的醪液，染黃曲霉：加入另一罐將近發(fā)酵成熟的醪液，pH下下降，黃曲霉自溶。降，黃曲霉自溶。 d.青霉菌：在青霉菌：在pH很低下能夠生長(zhǎng)。提前放罐。很低下能夠生長(zhǎng)。提前放罐。n發(fā)酵發(fā)酵后期污染后期污染n染菌量不太多，可

14、繼續(xù)發(fā)酵染菌量不太多，可繼續(xù)發(fā)酵n污染嚴(yán)重，則提前放罐污染嚴(yán)重，則提前放罐殺菌劑的添加：殺菌劑的添加：前期無(wú)必要，增加成本前期無(wú)必要，增加成本； 發(fā)現(xiàn)后加入，效果要具體評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)后加入，效果要具體評(píng)價(jià)（4）雜菌污染對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響）雜菌污染對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響n絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：pH不斷下降，菌絲大量自不斷下降，菌絲大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過(guò)濾困難溶，發(fā)酵液粘度增加，過(guò)濾困難 處理方法：處理方法：將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；先加絮先加絮凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀n雜菌分泌較多蛋白質(zhì)雜質(zhì)時(shí)，對(duì)發(fā)酵后處

15、理過(guò)程中采雜菌分泌較多蛋白質(zhì)雜質(zhì)時(shí)，對(duì)發(fā)酵后處理過(guò)程中采用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間極易發(fā)生乳化極易發(fā)生乳化1.1.染菌的不良后果染菌的不良后果 n消耗營(yíng)養(yǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)n合成新產(chǎn)物；菌體自溶、發(fā)粘等造成分離困難合成新產(chǎn)物；菌體自溶、發(fā)粘等造成分離困難n改變改變pHn分解產(chǎn)物分解產(chǎn)物n噬菌體破壞極大噬菌體破壞極大1. 染菌的檢查與判斷染菌的檢查與判斷n顯微鏡檢查法顯微鏡檢查法 鏡檢出雜菌需要一定時(shí)間鏡檢出雜菌需要一定時(shí)間n平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法：菌落平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法：菌落 噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑噬菌體檢查可

16、采用雙層平板法：噬菌斑n肉湯培養(yǎng)檢查法肉湯培養(yǎng)檢查法 n發(fā)酵過(guò)程的異?，F(xiàn)象判斷發(fā)酵過(guò)程的異?，F(xiàn)象判斷nDO2水平異常變化水平異常變化npH異常變化異常變化n尾氣尾氣CO2異常變化異常變化 122. 污染原因分析污染原因分析 n主要原因：主要原因： 種子帶菌種子帶菌 無(wú)菌空氣帶菌無(wú)菌空氣帶菌 設(shè)備滲漏設(shè)備滲漏 滅菌不徹底滅菌不徹底 操作失誤操作失誤 技術(shù)管理不善技術(shù)管理不善n n從污染時(shí)間看：早期污染可能與從污染時(shí)間看：早期污染可能與接種操作接種操作不當(dāng)有關(guān)；后期污染可能與不當(dāng)有關(guān)；后期污染可能與及中間補(bǔ)料有關(guān)。及中間補(bǔ)料有關(guān)。n從雜菌種類看：從雜菌種類看：n耐熱芽孢桿菌：與耐熱芽孢桿菌：與有關(guān)

17、有關(guān)n球菌、無(wú)芽孢桿菌：與球菌、無(wú)芽孢桿菌：與 有關(guān)有關(guān)n淺綠色菌落的雜菌：與水有關(guān)，即冷卻盤管滲漏淺綠色菌落的雜菌：與水有關(guān)，即冷卻盤管滲漏n霉菌：與霉菌：與有關(guān)，即無(wú)菌室滅菌不徹底或操作問(wèn)有關(guān)，即無(wú)菌室滅菌不徹底或操作問(wèn)題題n酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時(shí)間較長(zhǎng)酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時(shí)間較長(zhǎng) n從染菌幅度看：各個(gè)發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌，且所從染菌幅度看：各個(gè)發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌，且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問(wèn)題，若個(gè)別污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問(wèn)題，若個(gè)別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問(wèn)題。罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問(wèn)題。2. 污染原因分析污染原因分析 n2、生物農(nóng)藥生產(chǎn)中的

18、染菌問(wèn)題、生物農(nóng)藥生產(chǎn)中的染菌問(wèn)題n生物農(nóng)藥定義：又稱生物源農(nóng)藥，指直接利用自然界有益的生物從某些生物中制取的具有殺蟲、防病等作用的生物活性物質(zhì)n兩類：一類是活體生物農(nóng)藥，另一類是代謝產(chǎn)物生物農(nóng)藥n生物農(nóng)藥發(fā)酵生產(chǎn)包括：蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵、白僵菌等發(fā)酵n生產(chǎn)中要注意的問(wèn)題：保持菌種優(yōu)良的性狀，定期檢查無(wú)菌空氣制備系統(tǒng)，嚴(yán)格菌種移接的程序，發(fā)酵過(guò)程中控制罐壓及泡沫狀況，防止染菌。3. 預(yù)防預(yù)防n種子帶菌的防治種子帶菌的防治 n滅菌徹底滅菌徹底n接種可靠：無(wú)菌室及設(shè)備可靠，無(wú)菌操作可接種可靠：無(wú)菌室及設(shè)備可靠，無(wú)菌操作可靠靠n保藏可靠保藏可靠n過(guò)濾空氣帶菌的防治過(guò)濾空氣帶菌的防治n設(shè)備的滲漏或設(shè)備的滲漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治 “死角死角” n發(fā)酵罐的發(fā)酵罐的“死角死角” 法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支撐件撐件 口：人孔（或手孔）、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進(jìn)口：人孔（或手孔）、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進(jìn)料管口料管口 發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角死角” 消除方法：加強(qiáng)清洗并定期鏟除污垢；安裝放汽邊閥消除方法：加強(qiáng)清洗并定期鏟除污垢；安裝