病毒的純化和檢測-改

1、.第一節(jié)第一節(jié) 病毒的純化病毒的純化一、病毒純化前的準(zhǔn)備工作一、病毒純化前的準(zhǔn)備工作繁殖病毒繁殖病毒利用生物學(xué)方法純化病毒利用生物學(xué)方法純化病毒病毒感染的純化與診斷病毒感染的純化與診斷.二、標(biāo)本的采取與送檢二、標(biāo)本的采取與送檢 應(yīng)注意下列原則：應(yīng)注意下列原則： 1.對(duì)本身帶有雜菌對(duì)本身帶有雜菌 (如咽拭子、糞便如咽拭子、糞便) 或易或易受污染的標(biāo)本，要進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，受污染的標(biāo)本，要進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)使用抗生素。應(yīng)使用抗生素。 2.因病毒在室溫中易失去活性，標(biāo)本應(yīng)低因病毒在室溫中易失去活性，標(biāo)本應(yīng)低溫保存并盡快送檢。溫保存并盡快送檢。 3.血清學(xué)診斷標(biāo)本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和血清學(xué)診斷標(biāo)

2、本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后各取血清，以便對(duì)比雙份血清抗體效病后各取血清，以便對(duì)比雙份血清抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。.三、病毒和病毒成份的提純?nèi)?、病毒和病毒成份的提?病毒純度的判定依據(jù)：病毒純度的判定依據(jù)：物理均一性；物理均一性； 病毒滴度與蛋白含量的比例；病毒滴度與蛋白含量的比例； 免疫反應(yīng)單一而無非特異反應(yīng)；免疫反應(yīng)單一而無非特異反應(yīng)；結(jié)晶形成結(jié)晶形成 . 在病毒不失活的前提下，從宿主細(xì)胞中釋在病毒不失活的前提下，從宿主細(xì)胞中釋放出來；放出來； 病毒的純化可以應(yīng)用提純蛋白質(zhì)的技術(shù)方病毒的純化可以應(yīng)用提純蛋白質(zhì)的技術(shù)方法；法； 對(duì)大小、形狀和密度高度一致的病毒粒子，對(duì)大小、形狀和密度

3、高度一致的病毒粒子， 可以采用分級(jí)分離的技術(shù)?？梢圆捎梅旨?jí)分離的技術(shù)。 病毒提純的主要原則病毒提純的主要原則：.四、病毒萃取液的分級(jí)純化四、病毒萃取液的分級(jí)純化 沉淀法沉淀法中性鹽沉淀法中性鹽沉淀法 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法 離離 心心 法法 差速離心法差速離心法 密度梯度離心法密度梯度離心法 速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法 等密度區(qū)帶法等密度區(qū)帶法凝膠色譜法凝膠色譜法 電泳法電泳法. 病毒的感染單位病毒的感染單位（IU）：能夠引起宿主或宿主細(xì)）：能夠引起宿主或宿主細(xì)胞發(fā)生一定特異性反應(yīng)的病毒最小劑量；胞發(fā)生一定特異性反應(yīng)的病毒最小劑量

4、； 病毒效價(jià)：病毒效價(jià)：指單位體積指單位體積(ml)病毒懸液的感染單位病毒懸液的感染單位數(shù)目數(shù)目(IUml)或稱毒力或稱毒力 ； 噬菌體效價(jià)噬菌體效價(jià)（pfu) ：又稱噬菌斑形成單位數(shù)指單：又稱噬菌斑形成單位數(shù)指單位體積的噬菌體，能使感染細(xì)菌裂解，產(chǎn)生噬菌位體積的噬菌體，能使感染細(xì)菌裂解，產(chǎn)生噬菌斑的數(shù)量。斑的數(shù)量。因?yàn)椴《玖Ｗ訉?duì)細(xì)菌細(xì)胞感染率不會(huì)超過因?yàn)椴《玖Ｗ訉?duì)細(xì)菌細(xì)胞感染率不會(huì)超過100，所，所以根據(jù)噬菌斑或空斑計(jì)算出的病毒粒子數(shù)總比噬菌以根據(jù)噬菌斑或空斑計(jì)算出的病毒粒子數(shù)總比噬菌體電鏡下觀察數(shù)低。體電鏡下觀察數(shù)低。一、侵染力的測定一、侵染力的測定第二節(jié)第二節(jié) 病毒的檢測病毒的檢測. 半

5、致死劑量半致死劑量(LD50) ： 使半數(shù)宿主細(xì)胞死亡使半數(shù)宿主細(xì)胞死亡的病毒劑量稱的病毒劑量稱半致死劑量；半致死劑量； 半致感染劑量半致感染劑量(ID50) ：使半數(shù)宿主細(xì)胞發(fā)：使半數(shù)宿主細(xì)胞發(fā)生感染的病毒劑量生感染的病毒劑量 ； 半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50) ：使半數(shù)：使半數(shù)組織培養(yǎng)物發(fā)生感染，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)組織培養(yǎng)物發(fā)生感染，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)的病毒劑量。的病毒劑量。.二、病毒的培養(yǎng)二、病毒的培養(yǎng) 1.動(dòng)物接種動(dòng)物接種 是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動(dòng)物及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂擇敏感動(dòng)物

6、及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。角膜或皮內(nèi)。 2.雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng) 雞胚對(duì)多種病毒敏感。一般采用孵化雞胚對(duì)多種病毒敏感。一般采用孵化914天的雞胚，天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標(biāo)本接種于雞胚的不同部位，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標(biāo)本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。和卵黃囊等。 3.組織培養(yǎng)法組織培養(yǎng)法 (tissueculture) 或細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng) (cellculture)法法 是

7、將離體活組織塊或分散的組織細(xì)胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總是將離體活組織塊或分散的組織細(xì)胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。. 細(xì)胞的變化細(xì)胞的變化有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)可引起特有的細(xì)胞病變，稱為細(xì)有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)可引起特有的細(xì)胞病變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)胞病變效應(yīng) (CPE)(CPE)。常見的變化有細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于細(xì)胞膜，可使鄰近的細(xì)胞相互融合，形成多核巨細(xì)胞或稱融合細(xì)胞。 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培養(yǎng)細(xì)胞中形成胞漿或核內(nèi)的包涵體。 病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指

8、標(biāo)病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 2.紅細(xì)胞吸附紅細(xì)胞吸附 (hemadsorption,HAd) 流感或副流感病毒等感染細(xì)胞后，由于細(xì)胞膜上出現(xiàn)了血流感或副流感病毒等感染細(xì)胞后，由于細(xì)胞膜上出現(xiàn)了血凝素凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎動(dòng)物，具有吸附脊椎動(dòng)物 (豚鼠、豚鼠、雞、猴等雞、猴等) 紅細(xì)胞的能力，這一現(xiàn)象稱紅細(xì)胞吸附，常用紅細(xì)胞的能力，這一現(xiàn)象稱紅細(xì)胞吸附，常用來測定具有來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應(yīng)的的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應(yīng)的抗血清，則能中和細(xì)胞膜上的抗血清，則能中和細(xì)胞膜上的HA，HAd不再發(fā)生，稱紅不再發(fā)生，稱紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。

9、細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。. 3.干擾現(xiàn)象干擾現(xiàn)象(interference) 某些病毒感染細(xì)胞時(shí)不出現(xiàn)某些病毒感染細(xì)胞時(shí)不出現(xiàn)CPE或其他易于測出的變化或其他易于測出的變化(如如HAd)，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風(fēng)，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風(fēng)疹病毒感染疹病毒感染Vero細(xì)胞時(shí)細(xì)胞時(shí)CPE不明顯，但它能干擾后感染不明顯，但它能干擾后感染的?？刹《镜陌？刹《?(ECHOV) 的增殖，從而阻抑后者所特有的的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。 4.細(xì)胞代謝的改變細(xì)胞代謝的改變 病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH值改變，說明細(xì)值改變，說明細(xì)胞的代謝在病

10、毒感染后發(fā)生了變化。這種培養(yǎng)環(huán)境的生化胞的代謝在病毒感染后發(fā)生了變化。這種培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標(biāo)。改變也可作為判斷病毒增殖的指標(biāo)。.(二二) 病毒的數(shù)量與感染性測定病毒的數(shù)量與感染性測定 1.蝕斑測定蝕斑測定 是一種檢查和準(zhǔn)確滴定病毒感染性的方法。是一種檢查和準(zhǔn)確滴定病毒感染性的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將稀釋的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。結(jié)果是每一個(gè)有感染性的病毒在單層細(xì)胞中結(jié)果是每一個(gè)有感染性的病毒

11、在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染灶。用活性染料可產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染灶。用活性染料 (如如中性紅中性紅) 染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞的細(xì)胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑破壞的細(xì)胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑(plaque)。每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆。每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位粒形成的，稱作蝕斑形成單位 (plaque forming unit,PFU)。病毒懸液中的感染性。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用病毒量的滴度可用PFUml表示。表示。. 2.50%組織細(xì)胞感染量組織細(xì)胞感染量 (TCID50)測定法測定法 該方法是

12、測定病毒能使該方法是測定病毒能使50%的組織培養(yǎng)細(xì)的組織培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生感染的最小量。一般是將病毒懸胞發(fā)生感染的最小量。一般是將病毒懸液作液作10倍的系列稀釋，分別接種細(xì)胞，倍的系列稀釋，分別接種細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間后觀察經(jīng)一定時(shí)間后觀察CPE、血細(xì)胞吸附等、血細(xì)胞吸附等指標(biāo)，以最高稀釋度能感染指標(biāo)，以最高稀釋度能感染50%細(xì)胞的細(xì)胞的量為終點(diǎn)。最后用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出量為終點(diǎn)。最后用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出50%組織細(xì)胞感染量組織細(xì)胞感染量。.三、病毒感染的血清學(xué)診斷三、病毒感染的血清學(xué)診斷 原理是用已知病毒抗原來檢測病人血原理是用已知病毒抗原來檢測病人血清中有無相應(yīng)抗體，故須待病人感染后體清中有無相應(yīng)抗體，故須

13、待病人感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時(shí)才能檢出。內(nèi)產(chǎn)生抗體時(shí)才能檢出。 另外，在采取臨床標(biāo)本及病人血清應(yīng)另外，在采取臨床標(biāo)本及病人血清應(yīng)注意病程，必須采取患者急性期血清與恢注意病程，必須采取患者急性期血清與恢復(fù)期血清復(fù)期血清 (雙份血清雙份血清) 進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。若進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。若第第2次血清抗體滴度比第次血清抗體滴度比第1次高出次高出4倍以上時(shí)，倍以上時(shí)，才有診斷意義。才有診斷意義。.2.中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)(neutralizing test,NT test) 是病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中是病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)。和而失去感染性的一種試驗(yàn)。 中和抗體是

14、作用于病毒表面抗原中和抗體是作用于病毒表面抗原 (衣殼或衣殼或包膜包膜) 的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時(shí)間長。中和特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時(shí)間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗(yàn)適用于前有過隱性感染所致。因此，中和試驗(yàn)適用于人群免疫情況的調(diào)查，在臨床診斷上較少使用。人群免疫情況的調(diào)查，在臨床診斷上較少使用。1.免疫沉淀法免疫沉淀法使使Ag-Ab形成不溶性的沉淀。形成不溶性的沉淀。.3.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) (complement

15、fixation test,CF test) 如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測的抗體（或抗原），如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測的抗體（或抗原），則抗原抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補(bǔ)體；再加入指則抗原抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補(bǔ)體；再加入指示系統(tǒng)時(shí)，由于反應(yīng)液中已沒有游離的補(bǔ)體而示系統(tǒng)時(shí)，由于反應(yīng)液中已沒有游離的補(bǔ)體而不出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性。如果反不出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性。如果反應(yīng)系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體（或抗原），則應(yīng)系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體（或抗原），則在液體中仍有游離的補(bǔ)體存在，當(dāng)加入指示系在液體中仍有游離的補(bǔ)體存在，當(dāng)加入指示系統(tǒng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性。因統(tǒng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰

16、性。因此補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可用已知抗原來檢測相應(yīng)抗體，此補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可用已知抗原來檢測相應(yīng)抗體，或用已知抗體來檢測相應(yīng)抗原。或用已知抗體來檢測相應(yīng)抗原。 .補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)圖示補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)圖示受檢系統(tǒng)受檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)指示系統(tǒng)溶血反應(yīng)溶血反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)1、僅有抗原或抗體僅有抗原或抗體補(bǔ)體紅細(xì)胞溶血素陽性陽性陰性陰性2、抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)紅細(xì)胞溶血素陰性陰性陽性陽性抗原抗體補(bǔ)體抗原抗原/抗體抗體.5. 酶聯(lián)免疫吸附測定法（酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked enzyme-linked immunosorbent assay immunosorbent assay 簡稱簡稱EL

17、ISA ELISA ）以待測抗原（或抗體）與酶標(biāo)抗體（或抗原）以待測抗原（或抗體）與酶標(biāo)抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。來確定抗原（或抗體）含量。4.凝膠擴(kuò)散法凝膠擴(kuò)散法 Ag和和Ab相遇形成沉降帶。相遇形成沉降帶。.ELISA的基本類型 先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶并保持其免疫活性。測定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分

18、離抗的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測定。底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測定。 根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有競爭法競爭法、雙雙抗體夾心法抗體夾心法、間接法間接法三種類型的常用方法。三種類型的常用方法。.此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例體。以測定抗原為例, , 將抗原吸附于固相載體；加入將抗原吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量特異性抗體，使固相抗原與待測抗待測抗原和一定

19、量特異性抗體，使固相抗原與待測抗原二者競爭與抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于原二者競爭與抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的抗體與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。固相的抗體與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。競爭法競爭法.此法常用于測定抗原此法常用于測定抗原, , 將已知抗體吸附于固相載將已知抗體吸附于固相載體體, , 加入待檢標(biāo)本加入待檢標(biāo)本( (含相應(yīng)抗原含相應(yīng)抗原) )與之結(jié)合。溫與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測定。育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測定。雙抗體夾心法雙抗體夾心法.此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本于固相載體，加入待檢標(biāo)本( (含相應(yīng)抗體含相應(yīng)抗體) )與之與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體( (酶標(biāo)酶標(biāo)抗抗體抗抗體) )和底物進(jìn)行測定。和底物進(jìn)行測定。間接法間接法.四、病毒核酸檢測四、病毒核酸檢測 雜交法雜交法 用于病毒檢測的有斑點(diǎn)雜交、