存活蛋白重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在樹突狀細(xì)胞的表達(dá)

1、存活蛋白重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在樹突狀細(xì)胞的表達(dá)         08-03-08 14:15:00     編輯：studa20        作者：朱雄鵬，陳志哲，林旭，胡建達(dá)，李純團(tuán)，楊婷，許貞書，呂璐璐，陳彩平，張浪輝【摘要】  本研究旨在構(gòu)建含有人存活蛋白（survivin）基因的重組腺病毒載體，并探討其在轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)。以質(zhì)粒pcDNA3.0-survivin為模板

2、，通過PCR 擴(kuò)增獲得survivin基因全長序列。PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)酶切，定向插入腺病毒穿梭質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-survivin。通過雙酶切、PCR及插入片段測序鑒定后，將正確重組體pShuttle-CMV-survivin 轉(zhuǎn)化E.coli BJ5183 菌（含腺病毒骨架質(zhì)粒）并進(jìn)行同源重組，然后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，將此重組腺病毒質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切、線性化、純化，用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞。制備病毒上清并測定其滴度，將病毒上清轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，應(yīng)用Western blot方法分析survivin的表達(dá)。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了含

3、有人survivin基因的重組腺病毒，病毒滴度為： 2.65×109pfu/ml。Western blot鑒定顯示，經(jīng)重組腺病毒轉(zhuǎn)染的DC可有效表達(dá)survivin。結(jié)論：含survivin基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建成功，為下一步開展抗白血病免疫研究奠定實驗基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  腺病毒載體；存活蛋白基因；樹突狀細(xì)胞Construction of Recombinant Adenovirus Vector Containing Human Survivin Gene and Its Expression in Dentritic CellsAbstract 

4、0;  The study was aimed to  construct the recombinant adenovirus vectors containing human survivin gene，and  to   investigate their expression in  transfected  dentritic cells. Full length  cDNA encoding survivin was obtained  by PCR amplification from pl

5、asmid pcDNA3.0-survivin. The PCR product was  restricted，and then inserted into pShuttle-CMV. The plasmids of pShuttle-CMV-survivin were linearized  with Pme，and the fragment containing survivin was  ligated with pShuttle-CMV and transfected into E.coli BJ5183. After homologous recomb

6、ination in bacteria，the extracted plasmid from the  positive bacteria were linearized with Pac，transfected into HEK293 cells with liposome LipofectamineTM  2000.  Then，the  harvested adenovirus supernatants were transfected into  dendritic cells. The results showed that 

7、; the recombinant adenovirus-survivin was constructed successfully and its titer was about 2.65×109 pfu/ ml. The expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. It is concluded that the  recombinant adenovirus vector containing human survivin w

8、as constructed successfully，which may provide preliminary laboratory evidence for anti-leukemia immunotherapy.Key words  adenovirus vector; survivin gene; dendritic cell重組腺病毒載體具有宿主細(xì)胞范圍廣、高轉(zhuǎn)移效率、高滴度和高表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，是目前基因治療研究中應(yīng)用最為廣泛的載體之一1-3。存活蛋白（survivin）基因是腫瘤組織較為特異的基因，因而其編碼蛋白survivin成為腫瘤較理想的靶抗原之一。為開展樹突狀細(xì)胞(

9、DC)介導(dǎo)的抗白血病免疫治療，我們采用一種新的細(xì)菌內(nèi)同源重組制備重組腺病毒的AdEasyTM  XL系統(tǒng)，構(gòu)建了survivin基因重組腺病毒，制備了高滴度的病毒上清，并感染人樹突狀細(xì)胞，為下一步開展DC瘤苗治療研究提供實驗基礎(chǔ)。材料和方法材料質(zhì)粒pcDNA 3.0-survivin由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科、全軍優(yōu)生優(yōu)育研究所成勝權(quán)副教授惠贈；濃縮白細(xì)胞由省血液中心提供； AdEasyTM  XL腺病毒系統(tǒng)為Stratagene公司產(chǎn)品；高保真DNA聚合酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；普通Taq酶為晶美公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶 Kpn、Hind、Pme、Pac、T4連接酶為Bi

10、oLabs產(chǎn)品；純化試劑盒、小量抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購于中科開瑞公司；質(zhì)脂體、低熔點(diǎn)瓊脂糖為Invitrogen公司產(chǎn)品； PCR純化試劑盒、-半乳糖苷酶檢測試劑盒為Stratagene公司產(chǎn)品；總蛋白裂解酶、蛋白酶抑制劑為美國Pierce公司產(chǎn)品；兔抗人Survivin多克隆抗體為北京中杉生物技術(shù)公司產(chǎn)品；辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG、Western-Blotting lunimol試劑為Santa Cruz公司產(chǎn)品。引物設(shè)計根據(jù)GenBank中survivin mRNA的系列BC034148及腺病毒穿梭載體（pShuttle-CMV vector）的酶切位點(diǎn)（Kpn1和Hind）分別設(shè)計了

11、引物，F(xiàn)： 5-CGGGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTG-3，R： 5-CCCAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAG-3。目的片段的獲得以pcDNA3.0-survivin為模板，用合成的引物作PCR擴(kuò)增，體系為25 l，其中含10 ×buffer 2.5 l，dNTP (10 mmol/L) 0.5 l，模板質(zhì)粒0.5 l，上下游引物各0.5 l，Taq 酶0.1 l。熱循環(huán)程序為: 94預(yù)變性2分鐘，94變性30秒，55退火30秒，72延伸1分鐘，30 個循環(huán)后，72 再延伸7分鐘，4 保存。取10 l PCR反應(yīng)液在1%瓊脂糖中進(jìn)行電泳。然后采用的純化試

12、劑盒，按照說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。穿梭載體的構(gòu)建用Kpn1和Hind兩種內(nèi)切酶對survivin純化產(chǎn)物和pShuttle-CMV vector進(jìn)行酶切，將得到的酶切產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。利用小牛腸堿性磷酸酶對載體酶切片段進(jìn)行磷酸化處理，得到的產(chǎn)物片段survivin和載體，用T4 DNA連接酶在4條件下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5細(xì)胞，并通過帶有卡那霉素（50 g/ml）的LB平板篩選出帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌。然后以菌液為模板，用腺病毒載體通用引物進(jìn)行擴(kuò)增以篩選出帶有目的片段的細(xì)菌，用小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒得到重組質(zhì)粒（pShuttle-CMV-survivin），送泰京公司測

13、序。腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建同源重組  將帶有正確目的片段的穿梭載體（pShuttle-CMV-survivin）和對照質(zhì)粒（pShuttle-CMV）分別用Pme1進(jìn)行線性化，然后從凝膠中回收，并用來分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞（已含有病毒質(zhì)粒AdEasy-Vector）。用加卡那霉素（50 g/ml）的LB平板篩選帶有同源重組質(zhì)粒的E.coli  BJ5183，抽提質(zhì)粒，Pac1酶切鑒定。同源重組成功的質(zhì)粒，用腺病毒通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定重組質(zhì)粒是否帶有目的片段。之后用大抽質(zhì)粒試劑盒HiSpeedTM Plasmid Purification kit，分別

14、從含有同源重組質(zhì)粒（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV）的菌液進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提，以備轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝病毒時用。腺病毒的包裝  取同源重組質(zhì)粒5 g，用3 l的內(nèi)切酶Pac1進(jìn)行線性化，然后用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物利用質(zhì)脂體LipofectamineTM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染匯合度達(dá)到70%的293細(xì)胞。到第8天時，細(xì)胞大部分飄浮。用滴管把剩下貼壁的細(xì)胞吹起，收集細(xì)胞，離心，棄掉上清，加入1 ml PBS，重懸細(xì)胞，然后移到1.5 ml EP管中。在-70冰箱與37水浴反復(fù)凍融細(xì)胞4次，12 000×g離心10分鐘，收集上清，即為原代病毒上清（Ad-CM

15、V-survivin、Ad-CMV），置-70冰箱中保存。腺病毒的擴(kuò)增、滴度測定將得到的原代病毒上清轉(zhuǎn)染匯合度為70%的293細(xì)胞，按以上方法收集病毒。然后再將得到的病毒上清轉(zhuǎn)染兩瓶50 cm2 T形瓶、匯合度為70%的293細(xì)胞，利用空斑測定法對收集的病毒上清進(jìn)行滴度測定，最后放置-70冰箱中保存。腺病毒介導(dǎo)survivin在DC的表達(dá)DC的誘導(dǎo)  利用淋巴細(xì)胞分離液從濃縮白細(xì)胞中分離出單個核細(xì)胞，利用貼壁法得到單核細(xì)胞，加入生長因子GM-CSF、IL-4到培養(yǎng)液中混合培養(yǎng)，濃度皆為1 000  U/ml，隔天半換液，并補(bǔ)充生長因子。到第7天加入TNF-，使其終濃度達(dá)50

16、  ng/ml，到第9天收集細(xì)胞。外源基因survivin蛋白表達(dá)的Western blot鑒定  在DC培養(yǎng)到第7天加入TNF-的同時，按MOI為100分別用腺病毒Ad-CMV-survivin、Ad-CMV感染DC。第9天收集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染Ad-SVV(survivin)病毒的DC，加入總蛋白裂解酶100 l和蛋白酶抑制劑1 l，冰浴30分鐘，4，13 000×g，離心10分鐘。取上清直接于凝膠加樣孔內(nèi)，進(jìn)行電泳（濃縮膠60 V，1小時；分離膠100 V，2小時）。當(dāng)電泳即將結(jié)束時，從電泳槽上取下凝膠，將NC膜放于凝膠上方，濾紙放在NC膜上，置入轉(zhuǎn)膜裝置中，120 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)移2-3小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置封閉液中，用封閉液11 000稀釋特異性兔抗人存活蛋白（survivin）抗體。將膜從封閉液中取出，置于抗體稀釋液內(nèi)，4振蕩雜交過夜。用封閉液稀釋酶標(biāo)二抗；