呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒感染碩士論文

1、呼吸道合胞病毒F2蛋白亞單位疫苗的初步研究摘要 4-5 Abstract 5-6 插圖和附表清單 10-11 縮略語(yǔ)索引 11-12 第一章 呼吸道合胞病毒及F蛋白的相關(guān)研究 12-26 1.1 呼吸道合胞病毒的研究 12-16 1.1.1 RSV的發(fā)現(xiàn)史 12 1.1.2 RSV的發(fā)病率和流行性 12-13 1.1.3 RSV特征和結(jié)構(gòu)研究 13-14 1.1.4 RSV感染及機(jī)體的免疫反應(yīng) 14-15 1.1.5 RSV的檢測(cè)方法 15-16 1.1.6 RSV引起的相關(guān)疾病 16 1.2 RSV F蛋白及RSV疫苗研究 16-21 1.2.1 F蛋白作用 16-17 1.2.2 F蛋白結(jié)

2、構(gòu) 17-19 1.2.3 RSV疫苗研究 19-21 1.3 RSV疫苗佐劑和動(dòng)物模型 21-23 1.3.1 RSV疫苗佐劑 22 1.3.2 動(dòng)物模型 22-23 1.4 RSV感染的預(yù)防及治療 23-25 1.4.1 RSV預(yù)防 23 1.4.2 RSV治療 23-25 1.5 結(jié)束語(yǔ) 25-26 第二章 前言 26-28 第三章 F2基因的克隆 28-40 3.1 材料和方法 28-35 3.1.1 材料 28-32 3.1.2 方法 32-35 3.2 結(jié)果 35-37 3.2.1 Hela細(xì)胞培養(yǎng) 35 3.2.2 RSV培養(yǎng) 35 3.2.3 RNA提取結(jié)果 35-36 3.2

3、.4 F2基因擴(kuò)增 36-37 3.3 討論 37-39 3.3.1 細(xì)胞和病毒的培養(yǎng) 37 3.3.2 RNA的提取 37-38 3.3.3 RSV F2蛋白和基因引物設(shè)計(jì) 38-39 3.4 小結(jié) 39-40 第四章 表達(dá)載體F2/pGEX-6p-1的構(gòu)建 40-54 4.1 材料和方法 40-47 4.1.1 材料 40-41 4.1.2 方法 41-47 4.2 結(jié)果 47-51 4.2.1 菌落PCR鑒定F2/pMD18-T/DH5 47 4.2.2 重組質(zhì)粒F2/pMD18-T酶切鑒定 47-48 4.2.3 測(cè)序結(jié)果 48-49 4.2.4 菌落PCR鑒定F2/pGEX-6p-1

4、/DH5 49-50 4.2.5 重組質(zhì)粒F2/pGEX-6p-1酶切鑒定 50-51 4.3 討論 51-54 4.3.1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇 51 4.3.2 載體的選擇和構(gòu)建 51-52 4.3.3 測(cè)序結(jié)果分析 52-54 第五章 目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化 54-68 5.1 材料和方法 54-62 5.1.1 材料 54-58 5.1.2 方法 58-62 5.2 結(jié)果 62-65 5.2.1 目的蛋白的表達(dá) 62 5.2.2 Western Blotting檢測(cè)重組蛋白 62-63 5.2.3 目的蛋白的表達(dá)形式確定 63-64 5.2.4 目的蛋白的純化 64-65 5.3

5、討論 65-67 5.3.1 表達(dá)宿主的選擇 65 5.3.2 目的蛋白的表達(dá)形式 65 5.3.3 目的蛋白的純化 65-67 5.4 小結(jié) 67-68 第六章 目的蛋白免疫原性的測(cè)定 68-80 6.1 材料和方法 68-72 6.1.1 材料 68-69 6.1.2 方法 69-72 6.2 結(jié)果 72-77 6.2.1 蛋白定量結(jié)果 72 6.2.2 小鼠血清F2蛋白特異性IgG檢測(cè) 72-73 6.2.3 小鼠血清F2蛋白特異性IgG1檢測(cè) 73 6.2.4 小鼠血清F2蛋白特異性IgG2a檢測(cè) 73-74 6.2.5 IgG1/IgG2a結(jié)果 74-75 6.2.6 小鼠血清F2蛋

6、白特異性IgA檢測(cè) 75 6.2.7 小鼠呼吸道粘膜F2蛋白特異性IgA檢測(cè) 75-77 6.3 討論 77-79 6.3.1 疫苗佐劑的選取 77 6.3.2 疫苗的免疫原性初步評(píng)價(jià) 77-79 6.4 小結(jié) 79-80 第七章 全文總結(jié) 80-81 第八章 展望 81-82 致謝【學(xué)科專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)】 微生物學(xué) 【學(xué)位年度】 2009 【論文級(jí)別】 碩士 【關(guān)鍵詞】 呼吸道合胞病毒(RSV); F2亞單位; LT; 免疫原性; 【英文關(guān)鍵詞】 Respiratory syncytial virus; F2 subunit; LT; Immunogenicity; 【中文摘要】 呼吸道合胞病毒(R

7、espiratory syncytial virus,RSV)是世界范圍內(nèi)普遍引起嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原體之一,幾乎95%的幼兒在兩歲之前都感染過(guò)RSV,還可以引起毛細(xì)支氣管炎、肺炎、支氣管炎。自從該病毒發(fā)現(xiàn)以來(lái),雖然在RSV疫苗研制方面取得了一定效果,但目前還沒(méi)有一種完全安全、有效的疫苗問(wèn)世。 本論文在原核細(xì)胞中表達(dá)了RSV的一種包膜蛋白F的F2肽段,并探索了所表達(dá)的F2蛋白的免疫原性。 為了克隆F2蛋白基因和表達(dá)F2,在Hela細(xì)胞中培養(yǎng)RSV,病變達(dá)到80%以上時(shí)提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得F2蛋白基因。將F2基因插入pGEX-6p-l載體,重組表達(dá)載體F2/pGEX-6p-l

8、在大腸桿菌Rosetta中正確表達(dá)出了GST-F2蛋白,以包涵體的形式存在,表達(dá)量不足總蛋白的10%。通過(guò)對(duì)包涵體提取和洗滌,GST-F2蛋白可以占到50%。對(duì)包涵體變性、復(fù)性及使用GST親和層析純化,融合蛋白純度達(dá)到85%。 為了測(cè)定原核所表達(dá)的F2蛋白的免疫原性,36只實(shí)驗(yàn)小鼠分為6組,分別在0、2、4周免疫小鼠, A：PBS組；B：LT(大腸桿菌不耐熱腸毒素,LT)組；C:GST. 【英文摘要】 Respiratory syncytial virus (RSV) is one of the major pathogens of lower respiratory tract infection in infants worldwide. Almost 95% children are infected before age of 2, cause bronchiolitis, pneumonia, bronchitis. Since the virus was found, some RSV vaccine has been developed, However, a completely safe and effective vaccine is not available yet. In this study, we