GST pull-down實驗技術PPT課件

1、12021/3/9 Western Blot Western BlotGST pull-down原理原理：pGST pull down 是一種在體外研究蛋白質相互作用的是一種在體外研究蛋白質相互作用的方法。方法。p原理：原理： 利用DNA重組技術將已知蛋白與GST (Glutathione S transferase) 融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復合物混合時就可被吸附而分離。 Western BlotGST pull-down原理原理：p基本原理：基本原理：p假定A蛋白和B蛋白可能

2、有相互作用，將純化的融合GST標簽的A蛋白和純化的B蛋白以及能特異結合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定時間，充分洗滌未結合的蛋白，煮沸beads進行SDS-PAGE電泳，通過Western blotting檢測，可以看見GST-A和B分別對應的條帶,表明A和B因相互作用而被GST-A pull-down；而GST對照組始終僅有一個條帶。 Western Blot Western Blotp用于驗證兩個已知蛋白的相互作用用于驗證兩個已知蛋白的相互作用p篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白 Western Blotl GST-A融合蛋白的制備融合蛋白

3、的制備 B蛋白的制備蛋白的制備 體外蛋白的結合體外蛋白的結合 Western blot檢測檢測 Western Blot1.1 GST-A融合蛋白的表達融合蛋白的表達1.2 GST-A融合蛋白的純化融合蛋白的純化1. GST-A融合蛋白的制備融合蛋白的制備 Western Blot1、活化凍存菌種、活化凍存菌種GST和和GST-A：按：按1: 50比例將表達蛋白的凍存比例將表達蛋白的凍存菌液加入菌液加入5ml LB(Amp)，37，200 rpm培養(yǎng)過夜；培養(yǎng)過夜；2、將過夜培養(yǎng)物按、將過夜培養(yǎng)物按1:100比例接入比例接入200ml LB(Amp) ，220 rpm，30培養(yǎng)至培養(yǎng)至OD60

4、0=0.4-0.6;3、以預實驗確定的最佳、以預實驗確定的最佳IPTG濃度、時間和溫度誘導表達靶蛋濃度、時間和溫度誘導表達靶蛋白（白（IPTG 0.5mM，20，200 rpm培養(yǎng)培養(yǎng)1016小時）小時）;4、誘導適當時間后，、誘導適當時間后，4，5000 rpm/min離心離心10min后棄上清后棄上清（如需要該步沉淀能保存在（如需要該步沉淀能保存在-80）；）； Western Blot5、重懸沉淀：按、重懸沉淀：按10ml菌液沉淀用菌液沉淀用1ml PBS重懸，并加入重懸，并加入PMSF；6、冰上超聲沉淀重懸液：、冰上超聲沉淀重懸液：5S 間隔間隔5S 至懸液透明（一般可容性至懸液透明（

5、一般可容性蛋白：蛋白：10ml菌液沉淀用菌液沉淀用1ml PBS重懸液超聲重懸液超聲69min可透明）可透明）;7、12000 rpm/min，4離心離心10min，將上清轉移至新的離心管，將上清轉移至新的離心管，加加DTT至終濃度至終濃度1mmol/L。 Western Blot1、 在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積的在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積的50%Glutathione Sepharose 4B，4緩慢搖動，反應緩慢搖動，反應3060min；2、 3000 rpm/min，4離心離心3min，棄上清。該，棄上清。該Sepharose上結合上結合了了GST-A融合蛋白。融合蛋

6、白。3、在管中加入預冷的、在管中加入預冷的200微升微升PBS（沿壁加入，小心勿劇烈，以（沿壁加入，小心勿劇烈，以免打斷珠子與蛋白的連接），輕晃懸浮珠子，將免打斷珠子與蛋白的連接），輕晃懸浮珠子，將Sepharose洗滌洗滌一次，一次， 3000 rpm/min，4離心離心3min，棄上清，棄上清;4、重復步驟、重復步驟3三次（最后一次以小槍頭吸凈珠子表面液體，吸三次（最后一次以小槍頭吸凈珠子表面液體，吸凈但不吸走珠子），即獲得結合有凈但不吸走珠子），即獲得結合有GST-A融合蛋白的融合蛋白的Sepharose； Western Blot5、如果用于檢測，在、如果用于檢測，在Sepharose

7、 加入加入1520微升微升1蛋白電泳上蛋白電泳上樣緩沖液，于沸水中煮樣緩沖液，于沸水中煮510min。6、12000 rpm/min離心離心5min，取上清做，取上清做SDS-PAGE和和WB檢測。檢測。 Western Blot B蛋白的來源：蛋白的來源：1.1 (His)-B融合蛋白的原核表達與純化融合蛋白的原核表達與純化1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表達融合蛋白的真核表達2. B蛋白的制備蛋白的制備 Western Blot1、活化凍存菌種、活化凍存菌種His和和His-B：按：按1: 50比例將表達蛋白的凍存菌比例將表達蛋白的凍存菌液加入液加入5ml LB(Amp

8、)，37，200 rpm培養(yǎng)過夜；培養(yǎng)過夜；2、將過夜培養(yǎng)物按、將過夜培養(yǎng)物按1:100比例接入比例接入200ml LB(Amp) ，220rpm，30培養(yǎng)至培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6;3、以預實驗確定的最佳、以預實驗確定的最佳IPTG濃度、時間和溫度誘導表達靶蛋濃度、時間和溫度誘導表達靶蛋白（白（IPTG 0.5mM，28，200 rpm培養(yǎng)培養(yǎng)1016小時）小時）;4、誘導適當時間后，、誘導適當時間后，4，5000 rpm/min離心離心10min后棄上清后棄上清（如需要該步沉淀能保存在（如需要該步沉淀能保存在-80）；）； Western Blot5、重懸沉淀：按、重懸沉淀：按10

9、ml菌液沉淀用菌液沉淀用1ml PBS重懸，并加入重懸，并加入PMSF；6、冰上超聲沉淀重懸液：、冰上超聲沉淀重懸液：5S 間隔間隔5S 至懸液透明（一般可溶性至懸液透明（一般可溶性蛋白：蛋白：10ml菌液沉淀用菌液沉淀用1ml PBS重懸液超聲重懸液超聲69min可透明）可透明）;7、12000 rpm/min，4離心離心10min，將上清轉移至新的離心管，將上清轉移至新的離心管，加加DTT至終濃度至終濃度1mmol/L。 Western Blot1、 在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積的在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積的Ni-NTA珠子，珠子，4緩慢搖動，反應緩慢搖動，反應3060m

10、in；2、 3000 rpm/min，4離心離心5min，棄上清。該，棄上清。該Ni-NTA珠子上結珠子上結合了合了His-B融合蛋白。融合蛋白。3、在管中加入預冷的、在管中加入預冷的200微升微升Wash Buffer（沿壁加入，小心勿（沿壁加入，小心勿劇烈，以免打斷珠子與蛋白的連接），輕晃懸浮珠子，將珠子劇烈，以免打斷珠子與蛋白的連接），輕晃懸浮珠子，將珠子洗滌一次，洗滌一次， 3000 rpm/min，4離心離心3min，棄上清，棄上清;4、重復步驟、重復步驟3三次（最后一次以小槍頭吸凈珠子表面液體，吸三次（最后一次以小槍頭吸凈珠子表面液體，吸凈但不吸走珠子），即獲得結合有凈但不吸走珠子

11、），即獲得結合有His融合蛋白的融合蛋白的Ni-NTA； Western Blot5、加入適量體積、加入適量體積Elution Buffer，不必吹打，晃動洗脫蛋白。，不必吹打，晃動洗脫蛋白。 3000 rpm/min，4離心離心5min，吸凈上清，吸凈上清，His-B融合蛋白即在融合蛋白即在上清中；上清中；6、如果用于檢測，取、如果用于檢測，取10微升樣品，加入微升樣品，加入10微升微升1蛋白電泳上蛋白電泳上樣緩沖液，于沸水中煮樣緩沖液，于沸水中煮510min；7、12000 rpm/min離心離心5min，取上清做，取上清做SDS-PAGE和和WB檢測。檢測。 Western Blot1、

12、將編碼、將編碼B蛋白的蛋白的ORF克隆到編碼標簽蛋白（如克隆到編碼標簽蛋白（如HA/Myc/Flag）的真核表達載體上，進行細胞轉染；的真核表達載體上，進行細胞轉染；2、轉染后、轉染后3648h，取出細胞，用預冷，取出細胞，用預冷PBS洗洗2遍遍;3、加入適量體積、加入適量體積1RIPA（含（含PMSF），于冰上或），于冰上或4裂解細胞裂解細胞1030min;4、 12000 rpm/min，4離心離心5min，取上清保存在，取上清保存在-80或進行或進行下一步實驗。下一步實驗。 Western Blot3. 體外蛋白的結合體外蛋白的結合1、 將結合有將結合有GST-A融合蛋白的融合蛋白的Se

13、pharose 4B懸浮在適量體積緩懸浮在適量體積緩沖液中，加入沖液中，加入2030微升含有微升含有B蛋白的溶液（原核表達或真核表蛋白的溶液（原核表達或真核表達產(chǎn)物），同時采用結合有達產(chǎn)物），同時采用結合有GST蛋白的蛋白的Sepharose 作為陰性對照；作為陰性對照；2、 在水平搖床上在水平搖床上4晃動晃動48h；3、3000 rpm/min，4離心離心3min，棄上清（注意不要擾動底層，棄上清（注意不要擾動底層的的Sepharose）；）；4、加入預冷的、加入預冷的200微升緩沖液對微升緩沖液對Sepharose進行洗滌（沿壁加入，進行洗滌（沿壁加入，不要直接沖擊不要直接沖擊Sepharose，隨后輕柔晃動，使，隨后輕柔晃動，使Sepharose重懸即可重懸即可; Western Blot3. 體外蛋白的結合體外蛋白的結合5、3000 rpm/min，4離心離心3min，棄上清（注意不要擾動底層，棄上清（注意不要擾動底層的的Sepharose）；）；6、重復步驟、重復步驟5三次三次;7、吸