蠶豆染色病毒綜述

1、我與植物檢驗(yàn)檢疫學(xué)蠶豆染色病毒傳入中國及其檢驗(yàn)、防治淺析探究08生工1 俞偉祥 0800901110摘要：蠶豆染色病毒(Broadbean stain virus)簡稱BBSV ，是今年來發(fā)現(xiàn)的蠶豆病毒，其對蠶豆的減產(chǎn)可達(dá)70%。在1985年報(bào)道在四川、浙江等地檢測發(fā)生的BBSV是中國農(nóng)科院1984年從國際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心(ICARDA)引進(jìn)，分發(fā)給四川農(nóng)科院作物所等10個(gè)科研單位進(jìn)行品種試驗(yàn)。BBSV可以通過SPA ELISA法，瓊脂雙擴(kuò)散法，電鏡觀察和免疫電鏡，BBSV抗血清反應(yīng)以及最近的蠶豆染色病毒CPS基因的RTPCR檢測方法等方法檢測?，F(xiàn)在對于此種病毒主要使用撲滅進(jìn)行防治。關(guān)鍵詞

2、：蠶豆染色病毒，檢疫病毒，檢疫方法Abstract: Broadbean stain virus referred to BBSV, is this year to discover the beans virus,and Its to the reduction of horsebean is 70%.The BBSV was reported in Sichuan,Zhejiang,in 1985,what was detected was imported by Chinese Academy from ICARDA,and then distribute them to Sichuan

3、 Academy of Crops et al 10 scientific research units to experiment.BBSV could be tested by methods of SPA ELISA, AGAR double diffusion method, electron microscope and immune electron microscopy, BBSV anti serum reaction and BBSV CPS gene RT-PCR test method. Extinguish prevention is thought useful to

4、 guard against BBSV. Key words：BBSV, Quarantine virus, Quarantine method1 前言蠶豆,學(xué)名：Vicia faba Linn. 屬豆科，一年生或越年生草本。又稱胡豆、佛豆、胡豆、川豆、倭豆、羅漢豆。為糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物。蠶豆一般認(rèn)為起源于西南亞和北非。中國蠶豆相傳為西漢張騫自西域引入。在我國已有近2000的栽培歷史。蠶豆是富含蛋白質(zhì)的重要作物,據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織1981年的調(diào)查估計(jì),全世界蠶豆的種植面積約362萬公頃,中國的蠶豆面積約220萬公頃,占全世界總面積的60%以上。1根據(jù)氣候條件和耕作制度的特點(diǎn),我國蠶豆

5、的種植情況概分兩大區(qū)域,主要是分布在一長江流城及其以南地區(qū)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。蠶豆染色病毒(Broadbean stain virus)簡稱BBSV，系豇豆花葉病毒組成員2，病毒粒體直徑約2528nm。1965年Lloyd等首次在英國的蠶豆上發(fā)現(xiàn)并描述了這種病毒。病株表現(xiàn)葉片褪綠斑駁和花葉，外種皮呈壞死色避。自然條件下侵染蠶豆和小扁豆等豆科植物，BBSV 可通過花粉和種子傳播,在小扁豆上種傳率可高達(dá)32. 4% ,蠶豆的種傳率為4% 16% , 豌豆的種傳率為20%2，其傳毒介體有豆長吻象(Apionvorax)和豌豆根瘤象(Sitona lincatus)。BBSV 在歐洲、西亞、北非、

6、西非、東非的22個(gè)國家和地區(qū)都有報(bào)道3，已成為這些國家和地區(qū)蠶豆上的重要病害。蠶豆苗期或開花期之間感染減產(chǎn)40- 84，特別嚴(yán)重者絕產(chǎn)。2蠶豆感染該病毒后的典型癥狀為種子皮呈壞死色斑，嚴(yán)重時(shí)在外種皮形成連續(xù)壞死帶。苗期植株矮化或頂端枯死，病葉呈退色花葉或畸形。2 蠶豆花葉病毒傳入中國2.1蠶豆花葉病毒第一次在中國檢測發(fā)生1985年3月南京農(nóng)業(yè)大學(xué)方中達(dá)4等在我國一些蠶豆生產(chǎn)區(qū)調(diào)查蠶豆病毒病時(shí)，在四川農(nóng)科院作物所、湖北農(nóng)科院現(xiàn)代化所以及江蘇啟東縣農(nóng)科所的蠶試驗(yàn)田中發(fā)現(xiàn)一種我國未見報(bào)道的蠶豆病毒病，這是一種由種子帶毒的病毒。根據(jù)病株癥狀及對病株進(jìn)行生物檢測、血清學(xué)檢測和電鏡觀察結(jié)果，確認(rèn)病原為蠶豆

7、染色病毒(BBSV)。所有病株都發(fā)生在由敘利亞國際旱地農(nóng)業(yè)研究中心供種的試驗(yàn)區(qū)內(nèi),約1040%的小區(qū)或品系發(fā)病,株發(fā)病率在018%之間。在病株上未發(fā)現(xiàn)能傳毒的象甲,也無象甲的為害狀,病毒病尚未擴(kuò)散。在試驗(yàn)區(qū)以外的農(nóng)田里未發(fā)現(xiàn)有蠶豆染色病毒存在。1此病僅發(fā)生在國外引進(jìn)的蠶豆試驗(yàn)區(qū)中，所有品種均由中國農(nóng)科院作物品種資源所1984年從國際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心(ICARDA)引進(jìn)，分發(fā)給四川農(nóng)科院作物所等10個(gè)科研單位進(jìn)行品種試驗(yàn)。2.2蠶豆花葉病毒再次在中國檢測發(fā)生1990年作者在對山西蠶豆病毒病的調(diào)查時(shí)，從敘利亞1984年引進(jìn)的蠶豆種子種植和試驗(yàn)地中又發(fā)現(xiàn)此病。在對從敘利亞引進(jìn)的在山西太原種植的蠶

8、豆資源調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)了呈BBSV典型癥狀的病毒病，試種的50個(gè)小區(qū)盛品系中有7個(gè)小區(qū)（或品系)發(fā)病，發(fā)病小區(qū)(或品系)發(fā)病率約2.55，病株均系統(tǒng)感染，病葉典型癥狀為塊狀褪綠斑駁和花時(shí)，有的嚴(yán)重矮化，花色變暗。蠶豆田周圍種植的是麥類作物，無豆類作物種擅，以前也從未種過蠶豆：調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)豆長吻象甲或豌豆根瘤象，也未發(fā)現(xiàn)有象甲為害狀。從其癥狀和種傳等特性與過去報(bào)道的BBSV基本相同，經(jīng)過進(jìn)一步的檢驗(yàn)說明此病仍屬敘利亞引進(jìn)的蠶豆種子傳帶。23 蠶豆染色病毒(BBSV)檢測方法3.1 SPA ELISA3.1.1溶液配制3.1.1.1 包被緩沖液(0.1M pM96碳酸鹽緩沖液)Na2CO3·

9、1OH2 858g ； NaHCO3 588g；蒸餾水 1000ml3.1.1.2 洗滌液(0.02M PBST)Na2HPO4·12H2O 580g; NaH2PO4·2H2O 0.59g;Toween一2D 0.5ml;NaCl 8.5g;蒸餾水 1000ml3.1.1.3 稀釋液0.02M PBST 100ml;小牛血清 1ml3.1.1.4 底物緩沖液(隨用隨配)檸檬酸0.47gNaH2PO4·2H2O 1.84g;蒸餾水1000ml3.1.1.5 底物溶液鄰苯二胺4mg;底物緩沖液 10ml;使用前加30% H2O2 15,L3.1.1.6 終止液2M

10、H4SO43.1.1.7 2.5gml A-蛋白液(隨用隨配)市售A-蛋白純品，加lml蒸餾水， 配成母液分裝成50L瓶，存一20。用時(shí)取50L母液，加20ml包被緩沖液，即成2.5 gml蛋白液。3.1.2檢測步驟反應(yīng)板(用2.5gml A-蛋白液包被,每孔2001)孵育(373小時(shí)，4過夜，倒去包被液) 沖洗(洗滌液詵3次，每次5分鐘，存4備用) 第一次包被抗血清(BBSV 抗血清l2000或l4000)孵育(37l 2小時(shí)，吸出，供第二次包被用) 沖洗(同前) 加待測液(待涮葉片汁液150或l100，種胚液110或l20 孵育(37 3小時(shí)，倒去液體) 沖洗(同前) 第二次包被抗血清(同

11、第一次) 孵育(371小時(shí)，倒去包被液) 沖洗(同前)一加酶標(biāo)A蛋白(市售，濃度見說明書) 孵育(37半小時(shí)，倒去液體) 沖洗(同前) 加底物(每孔160-1801) 孵育(30半小時(shí),見顏色反應(yīng)) 加2M H2SO4終止反應(yīng)測OD值(492nm 波長)3.2 瓊脂雙擴(kuò)散法3.2.1 瓊脂板制備 6g精制瓊脂粉，加500ml生理鹽水(8.5gNaCl加1000ml蒸餾水)，加5ml 10 NaN3水浴融化，倒板至潔凈玻片，厚1.52mm，凝固后置保濕器中備用。3.2.2 反應(yīng)孔與反應(yīng)液排列 反應(yīng)孔一組7孔，中聞l孔，外周6孔，兩兩相對?？寡迮c其反應(yīng)抗原相對排列，生對照抗原與待測抗原相鄰排列。

12、3.2.3 反應(yīng)稀釋度 以待測原液或其l2為抗原，抗血清用l/l6 l/32。3.2.4 反應(yīng)條件 保濕，水平放置，624小時(shí)后觀察結(jié)果。3.2.5 判斷 凡與陽性對照沉淀線融合，為同一病毒。3.3 電鏡觀察和免疫電鏡3.3.1 制膜3.3.1.1Vormvar液配制：Formvar l 595E(MW24000-40000)0.25g，加氯仿至100m1，存4備用。3.3.1.2制膜：取潔凈載玻片，垂直蘸Formvar液， 晾干，以利刀玻片邊緣切斷。將玻片垂直插入無離子水中，使膜浮于水面，將洗凈的干銅阿排于膜上，銅網(wǎng)上鋪濾紙。將膜與銅嗣撈起。置濾紙上晾干，噴碳后使用。3.3.2 沾取法 取病

13、織(0.5 X lcm)，在玻片上用利刀切成細(xì)絲，加l一2滴無離子水。將銅網(wǎng)有膜一片置液滴上，0.5一2分鐘后取出，沖洗并吸干，以2 醋酸雙氧鈾(醋酸雙氧鈾l，加重蒸餾水或無離子水50ml，置棕色瓶中，存4備用)負(fù)染3-5分鐘，吸干后電鏡觀察。3.3.3 免疫電鏡3.3.3.1 誘捕法 銅網(wǎng)用1D-5抗血清包被10分鐘，沖洗，沾病汁液2o分鐘，沖洗，負(fù)染，觀察。3.3.3.2 誘捕和修飾 誘捕步驟與上相同，在負(fù)染前再以l0 抗血清包被l0分鐘，沖洗，負(fù)染，觀察。凡粒體外附有暗色抗體外套者為陽性反應(yīng)。563.4 BBSV抗血清的制備及特異性測定3.4.1 抗血清的制備 將BBSV (1990年山

14、西病樣的分離物)繁殖在成胡10號蠶豆上， 接種后17天采收， 提純，456g病葉+0.5M pH7.5PB900mJ(內(nèi)含0.2巰基乙醇) 過濾液(+5正丁醇+20氯仿，振動5分鐘靜置10分鐘,7000rpm15分鐘)取上清液加8PEG 加3NaC1攪拌至PEG溶化,置4冰箱過夜800rpm 30分鐘，取沉淀用0.01MPB pH7.5(內(nèi)含0 002MEDTA)懸浮過夜7000rpm 10分鐘，取上清液超離30000rpm 3小時(shí)， 取沉淀用0.01M PB懸浮過夜8000rpm 10分鐘取上清液(BBSV提純液)， 提純的病毒制劑濃為13mgm1(病毒得率28.5mgkg)。將其稀釋成5m

15、gml， 取2ml加2ml不完全佐劑，采用皮下多點(diǎn)注射，1周1次，共4次。第4次改為靜脈注射，不加佐劑。10天后采血。采用瓊脂免疫雙擴(kuò)散法測定抗血清效價(jià)為l64l128。3.4.2 抗血清特異性測定 用瓊脂免疫雙擴(kuò)散法測定制備抗血清和ICARCA 提供的BBSV 標(biāo)準(zhǔn)抗血清與BBSV 抗原(病汁液) 產(chǎn)生明顯的沉淀線， 且沉淀城完全相融；與蠶豆健汁維，蠶豆斑駁病毒，煙草環(huán)斑病毒，南方菜豆花葉病毒均不產(chǎn)生沉淀線；與南芥菜花葉病毒產(chǎn)生弱沉淀線，但此沉淀線與BBSV的沉淀線交叉， 所以均為陰性反應(yīng)，由此可見，此抗血清只與BBSV呈陽性反應(yīng)，其特異性強(qiáng)。74 蠶豆染色病毒（BBSV）防治1985年在四

16、川農(nóng)科院作物所、湖北農(nóng)科院現(xiàn)代化所、江蘇啟東縣農(nóng)科所等單位發(fā)現(xiàn)蠶豆染色病毒后，檢疫部門立即焚毀試驗(yàn)田全部國外引進(jìn)材料及周圍種植的部分地方蠶豆資源1990年在山西生物所試驗(yàn)田發(fā)現(xiàn)蠶豆染色病毒病后，因試驗(yàn)區(qū)完全處于隔離種植的環(huán)境下，僅銷毀病株，其它材料由當(dāng)?shù)刂参餀z疫部門進(jìn)行監(jiān)督管理，定期觀察病害發(fā)生情況，并根據(jù)有關(guān)檢疫要求將收獲的全部種子送交中國農(nóng)科院作物品種資源所國家農(nóng)作物引種隔離檢疫基地進(jìn)行種質(zhì)健康篩選。4 對于現(xiàn)在我國的防治主要在加強(qiáng)BBSV的檢驗(yàn)檢疫，尤其是蠶豆種子的檢驗(yàn)，種子是BBSV遠(yuǎn)距離傳播的主要載體。一般種傳率為4%-13%，我國的BBSV就是通過這一途徑傳播過來的。 由于我國現(xiàn)在還沒有大規(guī)模發(fā)現(xiàn)此種病毒，所以一經(jīng)發(fā)現(xiàn)應(yīng)該馬上給予銷毀病株，以及病毒的昆蟲的傳播媒介豆長吻象甲和豌豆葉象甲。參考文獻(xiàn)(References)：1 許志綱，方中達(dá).蠶豆染色病毒(BBSV)在中國的發(fā)生與鑒定J. 植物病理學(xué)報(bào) 1986年02期2 夏更生,鄒雪蓉,朱振東 等.蠶豆染色病毒的再次發(fā)生與鑒定J. 植物保護(hù) 1991,17(1):18-193 陳紅運(yùn)，陳青，黃峰 等.蠶豆染色病毒CPS 基因的序列測定及RT-PC