測定細菌數(shù)量的方法

1、測定細菌數(shù)量的方法1、計數(shù)器測定法：即用血細胞計數(shù)器進行計數(shù)。取一定體積的樣品細胞懸液置于血細胞計數(shù)器的計數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀察計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的(O.1mm3)，因而根據(jù)計數(shù)器刻度內(nèi)的細菌數(shù)，可計算樣品中的含菌數(shù)。本法簡便易行，可立即得出結(jié)果。本法不僅適于細菌計數(shù)，也適用于酵母菌及霉菌孢子計數(shù)。2、電子計數(shù)器計數(shù)法:電子計數(shù)器的工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個細胞，當(dāng)一個細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄裝置上。該法測定結(jié)果較準(zhǔn)確，但它只識別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。3、活細胞計數(shù)法常用的有平

2、板菌落計數(shù)法，是根據(jù)每個活的細菌能長出一個菌落的原理設(shè)計的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高，是一種檢測污染活菌數(shù)的方法，也是目前國際上許多國家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意：一般選取菌落數(shù)在30300之間的平板進行計數(shù)，過多或過少均不準(zhǔn)確；為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入O0012，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；本法限用于形成菌落的微生物。廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細菌檢驗，是最常用的活菌計數(shù)法。4、比濁法比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測定細菌的數(shù)量。細菌懸浮液的

3、濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。此法簡便快捷，但只能檢測含有大量細菌的懸浮液，得出相對的細菌數(shù)目，對顏色太深的樣品，不能用此法測定。5、測定細胞重量法此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進行稱重；干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后，以清水洗凈放人干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱重。此法適于菌體濃度較高的樣品，是測定絲狀真菌生長量的一種常用方法。6、測定細胞總氮量或總碳量氮、碳是細胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，測定氮、碳的含量可以推知細胞的質(zhì)量。此法適于細胞濃度較高的樣品。7、顏色改變單位法（c

4、olour change unit,簡稱CCU）這種方法通常用于很小，用一般的比濁法無法計數(shù)的微生物，比如支原體等，因為支原體的液體培養(yǎng)物是完全透明的，呈現(xiàn)為清亮透明紅色，因此無法用比濁法來計數(shù)，由于支原體固體培養(yǎng)很困難，用cfu法也不容易計數(shù)，因此需要用特殊的計數(shù)方法，即CCU法。它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo)，來計數(shù)微生物的相對含量的，下面以解脲脲原體為例，簡單介紹其操作：（1）.取12只無菌試管，每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。（2）.在第一管加入0.2ml待測解脲脲原體菌液，充分混勻，從中吸取0.2ml加入第二管，依次類推，10倍梯度稀釋，一直到最末一管（3）.于37度培養(yǎng)

5、，以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測菌液的CCU，也就是支原體的最大代謝活力，比如第六管出現(xiàn)顏色改變，他的相對濃度就是10的6次方CCU/ml.一般來說，比濁法和菌落計數(shù)法就可以滿足絕大多數(shù)細菌的計數(shù)，但是對支原體這樣比較特殊的微生物，用CCU法比較合適。 測定微生物生長的方法很多，各種方法均有其優(yōu)缺點，也不是在任何情況下都適用。在微生物學(xué)工作中一般常用的是平皿菌落計數(shù)法、計數(shù)器法和比濁法。至于哪種方法比較適合你，得根據(jù)你的具體條件而定。分離和純化一、目的要求掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化物的基本操作技術(shù)。二、基本原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分

6、離與純化。本實驗采用平板分離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，其包括兩個方面：1.選擇適合于待分離微生物的生長條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物；2.微生物在固體培養(yǎng)基生長形成的單個菌落可以是一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等計數(shù)來完成的。純培養(yǎng)的確定：1.確定其菌落觀察特征；2.結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征的確定。三、器材1.菌種 迷曲霉；2.培養(yǎng)基 高氏號培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基；3.溶液或試劑

7、 10%酚 盛9ml無菌水的試管 盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂；4.儀器或者其他用具 無菌玻璃涂棒 無菌吸管 接種環(huán) 無菌培養(yǎng)皿 鏈霉素和土樣 顯微鏡 血細胞計數(shù)板等。四、操作步驟1. 稀釋涂布平板法(1) 倒平板 將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基， 高氏號瓊脂培養(yǎng)基；馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至5560， 高氏號瓊脂培養(yǎng)基加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加入鏈霉素溶液?；靹蚝蠓謩e倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿；(2) 制備土壤稀釋溶液 稱取土樣10g，放入盛有90ml無菌水并帶入玻璃珠的三角燒瓶，振動約20min，使土樣與水分混合，將細胞分散.用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土

8、壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一個盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀釋的土壤溶液；(3) 涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個平板地面分別用記號筆寫上10-4，10-5，10-6三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-4，10-5，10-6三管土壤稀釋液中各取0.1ml對號放入已寫好室溫下靜置510min，使菌液吸附進培養(yǎng)基；(4) 培養(yǎng) 將高氏號瓊脂培養(yǎng)基平板;馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于28溫室中培養(yǎng)35day，肉膏蛋白胨平板倒置于37溫室中培養(yǎng)23day；(5) 挑菌落

9、 將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28和37溫室培養(yǎng)，大菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。2.平板劃線分離法(1)倒平板 按稀釋涂布平板倒平板，并用記號標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，土樣編號和實驗日期；(2) 劃線 在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線.劃線的方法很多，但無論采用那種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落；(3) 挑菌落 同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。庫克菌的檢測方法

10、耐酸耐熱菌（庫克）的檢測方法1 適用范圍本方法適用于清汁、濁汁、水和濃縮果汁中的耐酸耐熱菌的檢測。2 儀器和試劑2.1 恒溫水?。?0±1。2.2 恒溫培養(yǎng)箱：40±1。2.3 滅菌培養(yǎng)皿：直徑為90mm。2.4 滅菌試管：18×180mm。2.5 濾膜：0.45um水系一次性濾膜。2.6 酵母粉。 2.7 蛋白胨。2.8 瓊脂粉。 2.9 葡萄糖。 2.10 吐溫80。2.11 12.5%蘋果酸。2.12 滅菌蒸餾水。2.13 K氏培養(yǎng)基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸餾水，加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白胨、6.50g瓊脂粉、0.5g 葡萄糖

11、和0.5ml吐溫80，使其溶解，輕輕蓋上三角瓶的蓋子，在121滅菌25分鐘；在一個小燒杯中加入10ml蒸餾水和1.25克的蘋果酸，攪拌直至溶解，將蘋果酸的水溶液用0.45um的濾膜過濾，將處理過的蘋果酸水溶液加入到滅菌的K氏培養(yǎng)基中，攪拌均勻，使其pH值達到3.7±0.1。當(dāng)冷卻到大約50時，將K氏培養(yǎng)基傾注到培養(yǎng)皿中，凝固后在0-5的冰箱中儲存，有效期60天，并記錄配制日期。3 操作步驟3.1 樣品處理打開水浴鍋，調(diào)整溫度到80±1。以無菌操作，取10ml濃縮清汁于15ml滅菌的試管中，再移取10ml濃縮清汁于另一帶有溫度計的15mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管

12、的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當(dāng)溫度達到80±1，開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。冷卻至室溫，用90-100ml的滅菌蒸餾水將熱處理過的樣品轉(zhuǎn)入滅菌容器中，搖勻。將稀釋后的樣品溶液用0.45um的濾膜真空過濾。打開水浴鍋，調(diào)整溫度到80±1。以無菌操作，取150ml清汁（或水）于已滅過菌的玻璃樣品瓶中，再移取150ml清汁（或水）于另一帶有溫度計的玻璃樣品瓶中，作為溫度控制用，蓋上樣品瓶的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當(dāng)溫度達到80±1，開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。將熱處理過的樣品冷卻至室溫，用0.45um

13、的濾膜真空過濾。打開水浴鍋，調(diào)整溫度到80±1。以無菌操作,取20ml濁汁于已滅過菌的試管中,再移取20ml濁汁于另一帶有溫度計的20mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中,當(dāng)溫度達到80±1時,開始計時，維持13分鐘（用計時器計時）。冷卻至室溫，將熱處理的樣品用0.45um的濾膜真空過濾。3.2 培養(yǎng)及計數(shù)取掉過濾器的上部裝置，用滅菌的鑷子，將過濾膜從過濾器上取下放在K氏培養(yǎng)基上，輕敲數(shù)次，以保證濾膜與培養(yǎng)基接觸。倒置于40-41恒溫培養(yǎng)箱中，在恒溫培養(yǎng)箱底部放置一個有水的盤子，以調(diào)整恒溫培養(yǎng)箱的濕度，培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結(jié)束

14、后，記錄該培養(yǎng)溫度下濾膜上的菌落數(shù)。根據(jù)對樣品的污染情況，可選擇稀釋度。用滅菌吸管吸取25ml樣品，加入到225ml滅菌蒸餾水中，做成1：10的稀釋度；用滅菌吸管吸取1：10的稀釋液25ml，加入到225ml滅菌蒸餾水中，做成1：100的稀釋度，稀釋后的樣品的檢測方法同上。培養(yǎng)結(jié)束后，記錄濾膜上的菌落數(shù)，并按相應(yīng)的稀釋度進行計算。4 數(shù)據(jù)處理結(jié)果報告10ml的濃縮清汁樣品中含有的菌落數(shù),報告單位為cfu/10ml。結(jié)果報告150ml的清汁（或水）樣品中含有的菌落數(shù)，報告單位為cfu/150ml。結(jié)果報告20ml的濁汁樣品中含有的菌落數(shù)，報告單位為cfu/20ml。參考資料：庫克實驗室耐熱耐酸菌

15、的檢測方法。顯微技術(shù)顯微技術(shù)顯微技術(shù)是微生物檢驗技術(shù)中最常用的技術(shù)之一。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。而在食品微生物檢驗中最常用的還是普通光學(xué)顯微鏡。一、普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和基本原理：1.結(jié)構(gòu)：光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)放大系統(tǒng)和機械裝置兩部分組成。光學(xué)系統(tǒng)一般包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等；機械系統(tǒng)一般包括鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡臺、鏡臂和底座等。（圖）標(biāo)本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短。焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。油鏡的工作距離很短，使用時需格外注意。目鏡只起放大作用，不能提高分辨

16、率，標(biāo)準(zhǔn)目鏡的放大倍數(shù)是十倍。聚光鏡能使光線照射標(biāo)本后進入物鏡，形成一個大角度的錐形光柱，因而對提高物鏡分辨率是很重要的。聚光鏡可以上下移動，以調(diào)節(jié)光的明暗，可變光闌可以調(diào)節(jié)入射光束的大小。顯微鏡用光源，自然光和燈光都可以，以燈光較好，因光色和強度都容易控制。一般的顯微鏡可用普通的燈光，質(zhì)量高的顯微鏡要用顯微鏡燈，才能充分發(fā)揮其性能。有些需要很強照明，如暗視野照明、攝影等，常常使用鹵素?zé)糇鳛楣庠?。圖光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)圖2.原理：顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉

17、眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時折射率為1，而香柏油的折射率為1.51，和載片玻璃的折射率（1.52）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過載片、香柏油進入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。 二、普通顯微鏡的使用方法1、低倍鏡觀察先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動反光鏡，調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細調(diào)對準(zhǔn)焦距進行觀察。除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點。如果視野中出現(xiàn)外界物體

18、的圖像，可以將聚光鏡稍微下降，圖像就可以消失。聚光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮?，以控制射入光線的量，增加明暗差。2、高倍鏡觀察顯微鏡的設(shè)計一般是共焦點的。低倍鏡對準(zhǔn)焦點后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡基本上也對準(zhǔn)焦點，只要稍微轉(zhuǎn)動微調(diào)即可。有些簡易的顯微鏡不是共焦點，或者是由于物鏡的更換而達不到共焦點，就要采取將高倍物鏡下移，再向上調(diào)準(zhǔn)焦點的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度。稍微上下移動聚光鏡，觀察圖像是否清晰。3、油浸鏡觀察油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時，一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。載玻片標(biāo)本也可以不經(jīng)過低倍和高倍物鏡，

19、直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動止降裝置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點。沒有自動止降裝置的，對準(zhǔn)焦點的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀察，將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止，然后用微調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點。使用油浸鏡時，鏡臺要保持水平，防止油流動。油浸鏡所用的油要潔凈，聚光鏡要提高到最高點，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會降低數(shù)值口徑而影響分辨率。無論是油浸鏡或高倍鏡觀察，都宜用可調(diào)節(jié)的顯微鏡燈作光源。三、普通顯微鏡的保養(yǎng)顯微鏡是精密貴重的儀器，必須很好地保養(yǎng)。顯微鏡用完后要放回原來的鏡箱或鏡柜中，同時要注意下列事項：1、觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本。2、

20、用過油浸鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭23次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。3、轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。4、將鏡身下降到最低位置，調(diào)節(jié)好鏡臺上標(biāo)本移動器的位置，罩上防塵套。鏡頭的保護最為重要。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙擦拭。擦鏡紙要放在紙盒中，以防沾染灰塵。切勿用手絹或紗布等擦鏡頭。物鏡在必要時可以用溶劑清洗，但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑。根據(jù)不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脫脂棉花團蘸取少量的二甲苯，輕擦，并立即用擦鏡紙將二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能殘留的短絨。目鏡是否清潔可

21、以在顯微鏡下檢視。轉(zhuǎn)動目鏡，如果視野中可以看到污點隨著轉(zhuǎn)動，則說明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。如果還不能除去，再擦拭下面的透鏡，擦過后用洗耳球?qū)⒍探q吹去。在擦拭目鏡或由于其他原因需要取下目鏡時，都要用擦鏡紙將鏡筒的口蓋好，以防灰塵進入鏡筒內(nèi)，落在鏡筒下面的物鏡上。四、顯微計數(shù)利用血球計數(shù)器在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常見的微生物計總數(shù)的方法。因為計數(shù)器載片和蓋片間的容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算單位體積內(nèi)微生物總數(shù)。血球計數(shù)器是一只特制載玻片。載片上有兩個方格網(wǎng)，每一方格網(wǎng)共分九個大方格，其中間的一個大方格用來做微生物計數(shù)，所以又稱為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有

22、兩種，一種是每個大方格分成16個中方格，每中方格又分成25個小方格。另一種是一個大方格分25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，不論哪一種，一個大方格，都等分成（25×16或16×25）400個小方格。（圖）因為每個大方格邊長為1毫米，載片與蓋片間距離為0.1毫米，所以每個計數(shù)室（1個大方格）體積為0.1圖兩種血球計數(shù)板a. 25X16計數(shù)板 b.16X25計數(shù)板立方毫米。測出每個中方格菌數(shù)，就可以算出一個大方格的菌數(shù)，由此推算出1毫升菌液內(nèi)所含的菌數(shù)。一個大方格是16個中方格時，應(yīng)當(dāng)數(shù)4角4個中方格（即100個小方格）的菌數(shù)，一個大方格是25個中方格時，除取4角4個中

23、方格外，還要數(shù)中央一個中方格（即為80個小方格）的菌數(shù)。計算公式如下：16×25計數(shù)板：總菌數(shù)/ml= ×400×10000×稀釋倍數(shù)=每個小方格內(nèi)菌數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù)25×16計數(shù)板：總菌數(shù)/ml= ×400×10000×稀釋倍數(shù)=每小方格內(nèi)菌數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù)染色技術(shù)染色技術(shù) 由于微生物細胞含有大量水分（一般在80-90%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細胞的運動性和直接計算

24、菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進行觀察。但是，任何一項技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細胞的真實情況，染色觀察時必須注意。本節(jié)包括四部分：一、染色的基本原理微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質(zhì)對染料的毛細現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)細胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)

25、染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。細菌的等電點較低，pH值大約在25之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細菌常和帶陽電的堿性染料進行結(jié)合。所以，在細菌學(xué)上常用堿性染料進行染色。影響染色的其它因素，還有菌體細胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用

26、等，也都能影響細菌的染色。 二、染料的種類和選擇染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分復(fù)雜，有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數(shù)染料為帶色的有機酸或堿類，難溶于水，而易溶于有機溶劑中。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿性染料、中性（復(fù)合）染料和單純?nèi)玖纤拇箢悺?、酸性染料這類染料電離后染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時，細

27、菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。2、堿性染料這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細菌易被堿性染料染色。3、中性（復(fù)合）染料酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性（復(fù)合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細胞核的染色。4、單純?nèi)玖线@類染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于被染物而定，因為它們大多數(shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。三、制片和染色的基本程序

28、微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。1、制片在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過多聚成集團，不利觀察個體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。2、自然干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加

29、熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。3、固定標(biāo)本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：）殺死微生物，固定細胞結(jié)構(gòu)。）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。）改變?nèi)玖蠈毎耐ㄍ感?，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠端），標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過34次，共約23秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60）,放置待冷后，進行染色。以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應(yīng)用較多普遍，但是應(yīng)當(dāng)指出，在研究微生物細胞結(jié)構(gòu)時不適用，應(yīng)采用化學(xué)固定法。化學(xué)固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙

30、酮，12%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結(jié)構(gòu)，故較常用。應(yīng)用餓酸固定細胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細管，在毛細管中注入少量的12%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過12分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。4、染色標(biāo)本固定后，滴加染色液。染色的時間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時染色時還要加熱。染料作用標(biāo)本的時間平均約13分鐘，而所有的染色時間內(nèi)，整個涂片（或有標(biāo)本的部分）應(yīng)該浸在染料之中。若作復(fù)合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時進行

31、。、脫色用醇類或酸類處理染色的細胞，使之脫色。可檢查染料與細胞結(jié)合的穩(wěn)定程度，鑒別不同種類的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。、復(fù)染脫色后再用一種染色劑進行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進行染色，就是復(fù)染。、水洗染色到一定的時候，用細小的水流從標(biāo)本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。、干燥著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。、鏡檢干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察。綜上所述，染色的基本程序如下：制片固定媒染染色脫色復(fù)染水洗干燥鏡檢。四、

32、染色方法微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽胞、鞭毛、細胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。、單染色法用一種染色劑對涂片進行染色，簡便易行，適于進行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅

33、等。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強酸性（低于細菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。染色結(jié)果依染料不同而不同：石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時間短，菌體呈紅色。美蘭染色液：著色慢，時間長，效果清晰，菌體呈蘭色。草酸銨結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。、革蘭氏染色法革蘭氏染色法是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為

34、革蘭氏陰性菌（G）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣?，F(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。

35、所以染色時的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細胞壁等對結(jié)晶紫碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是：）涂片固定。）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。）自來水沖洗。）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。）水洗，用吸水紙吸去水分。）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分。）蕃紅梁色液（?。┤?0秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反

36、應(yīng)菌體都呈紅色。滅菌和消毒滅菌和消毒消毒和滅菌兩個詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。消毒是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法，而滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。一、物理方法1、溫度利用溫度進行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。）干熱滅菌法:a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒瀯游锏氖w等的滅菌。b.干熱空氣滅

37、菌法：這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160°C，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。）濕熱滅菌法:在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因為一方面細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含水量高，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質(zhì)有高度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。a.巴氏消毒法：有些食物會因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養(yǎng)和風(fēng)味，又進行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在62°C，30分鐘既可達到消毒目的。此法為法國微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴

38、氏消毒法。b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分鐘，即可殺死細菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸，則效果更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100°C，1530分鐘，殺死其中的營養(yǎng)體。然后冷卻，放入37°C恒溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。第2天再重復(fù)上述步驟，三次左右，就可達到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，適于推廣，但操作麻煩，所需時間長。d. 加壓蒸汽

39、滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測和微生物學(xué)實驗室中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，水的沸點也隨之提高。在蒸汽壓達到1.055公斤/厘米2時，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達到121°C。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在1520分鐘便會被殺死，而達到滅菌目的。如滅菌的對象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時間。在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌

40、鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應(yīng)關(guān)系，這樣會大大降低滅菌效果。）影響滅菌的因素a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏感性不同。多數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病毒在5065°C，10分鐘就會被殺死；但各種孢子、特別是芽孢最能抗熱，其中抗熱性最強的是嗜熱脂肪芽孢桿菌，要在121°C，12分鐘才被殺死。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感。b.微生物的數(shù)量多少顯然會影響滅菌的效果，數(shù)量越多，熱死時間越長。c.培養(yǎng)基的成分與組成也會影響滅菌效果。一般地講，蛋白質(zhì)、糖或脂肪存在，則提高抗熱性，pH在7附近，抗熱性最強，偏向兩極，則抗熱能力下降，而不同的鹽類可

41、能對滅菌產(chǎn)生不同的影響；固體培養(yǎng)基要比液體培養(yǎng)基滅菌時間長。）滅菌對培養(yǎng)基成分的影響a.pH值普遍下降。b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。c.不少培養(yǎng)基顏色加深。d.體積和濃度有所變化。e.營養(yǎng)成分有時受到破壞。、輻射利用輻射進行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學(xué)藥劑消毒的缺點，所以應(yīng)用越來越廣，目前主要應(yīng)用在以下幾個方面：）接種室、手術(shù)室、食品、藥物包裝室常應(yīng)用紫外線殺菌。）應(yīng)用射線作食品表面殺菌，射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。、過濾采用機械方法，設(shè)計

42、一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但是比細菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時會給實驗帶來一定的麻煩。二、化學(xué)方法二、化學(xué)方法一般化學(xué)藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物，稱為防腐劑。但是一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴(yán)格區(qū)分。消毒劑在低濃度時也

43、能殺菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐劑沒有選擇性，因此對一切活細胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環(huán)境的消毒。常用的化學(xué)消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。培養(yǎng)基制備技術(shù)培養(yǎng)基制備技術(shù) 一、玻璃器皿的清洗在制備培養(yǎng)基的過程中，首先要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況，經(jīng)過一定的處理，洗刷干凈。有的還要進行包裝，經(jīng)過滅菌等準(zhǔn)備就緒后，才能使用。1、新購的玻璃器皿除去包裝沾染的污垢后，先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈，再浸泡于的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時

44、，使游離的堿性物質(zhì)除去，再以流水沖凈。對容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸，數(shù)分鐘后傾去鹽酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。2、用過的玻璃器皿凡確無病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用后可隨時沖洗，吸取過化學(xué)試劑的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定數(shù)量后再集中進行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必須經(jīng)過適當(dāng)消毒后，將污垢除去，用皂液洗刷，再用流水沖洗干凈。若用皂液未能洗凈的器皿，可用洗液浸泡適當(dāng)時間后再用清水洗凈。洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸，其作用是將有機物氧化成可溶性物質(zhì)，以便沖洗。洗液有很強的腐蝕作用，使用時應(yīng)特別小心

45、，避免濺到衣服、身體和其他物品上。二、培養(yǎng)基的類型在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基(Media)。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn)，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。1、根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分，可以將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。）天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確

46、切知道它的化學(xué)成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實驗室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號等因素的影響。）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。）半合成培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。、根據(jù)

47、培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分，可以分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。）液體培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。）固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。在實驗室中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物測定等。）半固體培養(yǎng)基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.21%之間。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。

48、、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分，可分為選擇培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。）選擇培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的菌種生長的培養(yǎng)基，稱之為選擇培養(yǎng)基。如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生長；而制霉菌素、灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長；結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽性細菌的生長等。）增殖培養(yǎng)基 在自然界中，不同種的微生物常生活在一起，為了分離我們所需要的微生物，在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，逐漸淘汰其它微生物，這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基常用于菌種篩選和選擇增菌中。在某種程度上講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。）鑒別培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中

49、加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助開快速鑒別某種微生物。這樣的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)基。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍培養(yǎng)基就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）。另外，根據(jù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是否“完全”，可以分為基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和補充培養(yǎng)基，這類術(shù)語主要是用在微生物遺傳學(xué)中。根據(jù)培養(yǎng)基

50、用于生產(chǎn)的目的來區(qū)分，可以分為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。還有專門用于培養(yǎng)病毒等寄生微生物的活組織培養(yǎng)基，如雞胚等；專門用于培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的無機鹽培養(yǎng)基等。三、培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項 、培養(yǎng)基配方的選定同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進行配制外，一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。、培養(yǎng)基的制備記錄每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)

51、生混亂。、培養(yǎng)基成分的稱取培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方面軍做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應(yīng)進行一次檢查。、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細菌不易生長。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。待大部分固體成分溶化

52、后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補足。、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應(yīng)隨時注意探索經(jīng)驗、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。、培養(yǎng)基的過濾澄清液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀，因此 ，須要采用過濾或其它澄清方法以達到

53、此項要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。如過濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至5560°C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入12個雞蛋的蛋白，強力振搖35分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121°C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。、培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容

54、器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。、培養(yǎng)基的滅菌一般培養(yǎng)基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌

55、法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50°C左右的培養(yǎng)基中。瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55-60時，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入36±1°C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種12管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時，如無菌生長或生長不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該

56、批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。10、培養(yǎng)基的保存培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標(biāo)簽。接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)一、接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。、接種工具和方法在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。（圖）圖接種和分離工具常用的接

57、種方法有以下幾種：）劃線接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。）三點接種 在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點外，也有一點或多點進行接種的。）穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。）澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷