細(xì)菌感受態(tài)的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

1、細(xì)菌感受態(tài)的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過實(shí)驗(yàn)學(xué)會感受態(tài)細(xì)胞的制備方法和DNA轉(zhuǎn)化的最基本操作，以及如何提高轉(zhuǎn)化效率的思路。本實(shí)驗(yàn)綜合因素較多，難度較大，是分子生物學(xué)中的一個很關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)手段。實(shí)驗(yàn)原理 轉(zhuǎn)化是指某一細(xì)胞系由于接受了外源DNA，而導(dǎo)致其原來的遺傳性狀發(fā)生改變，這種遺傳性狀包括遺傳型和表型的改變。 感受態(tài)是受體菌能接受外源DNA能力的一種生理狀態(tài)。用CaCl2處理細(xì)菌，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使質(zhì)粒DNA能夠穿過細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。然后在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化處理過的細(xì)菌，轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌可以在選擇性培養(yǎng)基上生長形成菌落。  本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)粒pUC118轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-

2、5a，通過氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)材料和試劑 （一）實(shí)驗(yàn)材料  大腸桿菌DH-5a 質(zhì)粒pUC118（ampicillin，AmpR） （二）培養(yǎng)基和試劑 1. LB液體培養(yǎng)基(%) 胰蛋白胨（Tryptone） 0.5 酵母浸出粉（Yeast extract） 1.0 NaCl 0.5 pH 7.27.4（用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)） （分裝：20ml/250ml三角瓶，每組2瓶。3ml/試管，每組2管。0.07Mpa高壓滅菌30分鐘）。 2. LB固體培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基加入1.6%的瓊脂粉即可。  （分裝：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克瓊脂粉，每組

3、1瓶。0.07Mpa高壓滅菌30分鐘）。 3. 抗生素：氨芐青霉素（ampicillin,，Amp），配制成100mg/ml備用。 4. 0.1mol/L CaCl2溶液  (配制方法：稱取1.1克無水CaCl2，溶于90ml蒸餾水中，定容至100ml，裝于250ml三角瓶中，0.07Mpa高壓滅菌30分鐘，4保存。） （三）器材 接種針 10ml移液管 50ml塑料離心管 5ml移液管 90mm培養(yǎng)皿 1ml移液管 1.5ml Eppendorf管 200ml吸頭 三角爬 15×150試管 冰塊 試管鋁帽 牛皮紙 紗布蓋 線繩 硫酸紙 （四）儀器 凈化工作臺 搖床機(jī) 恒溫

4、水浴鍋 離心機(jī) 培養(yǎng)箱以下均需無菌操作 （一）感受態(tài)細(xì)胞的制備 1. 大腸桿菌DH-5a 冷凍保存的菌種，挑取一環(huán)，劃線接種在LB固體培養(yǎng)基平板上（活化菌種），37培養(yǎng)過夜（約16小時）。 2. 從長好的平板上挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)接在含有3ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜（約16小時）。 3. 取0.3ml菌液接種于20ml LB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37振蕩培養(yǎng)23小時，待OD600值達(dá)到0.30.4時，取下三角瓶，立即置冰浴1015 分鐘。 4. 將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個滅菌的50ml離心管中，4 3000r/min離心10分鐘，棄去上清液（盡可能將所有的上清液去凈

5、），收集菌體。 5. 加入20ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重新懸浮菌體，使菌體分散均勻，置冰浴中30分鐘。 6. 4 3000r/min離心10分鐘，棄去上清液（盡可能將所有的上清液去凈）。 7. 再加入2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新懸浮菌體（操作要輕）。在4冰箱中放置1224小時，即可應(yīng)用于DNA轉(zhuǎn)化。 （二）細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 1. 取大腸桿菌DH-5a新鮮感受態(tài)細(xì)胞100ml于1.5ml Eppendorf管中，加入50100ng質(zhì)粒pUC118 DNA，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰浴中放置30分鐘。 2. 42熱休克120秒，不要搖動Eppendorf管。 3. 加入LB液體培養(yǎng)基900ml，37保溫60分鐘。 4. 取100ml轉(zhuǎn)化液涂布在含氨芐青霉素（Amp）100 mg/ml的LB固體平板上，37倒置培養(yǎng)1624小時。 5觀察平板，長出的菌落可能就是轉(zhuǎn)化子，可進(jìn)一步提取質(zhì)粒鑒定。【提示】 實(shí)驗(yàn)操作中注意的問題 1. DNA與感受態(tài)細(xì)胞混合后，一定要在冰浴條件下操作，如果溫度時高時低，轉(zhuǎn)化效率極差。 2. Eppendorf管蓋緊，以免反應(yīng)液溢出或外面水進(jìn)入而污染。 3. 42熱處理時很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，但溫度要準(zhǔn)確。 4. 涂布轉(zhuǎn)化液時，要避免反復(fù)來回涂布，因?yàn)楦惺?/p>