黃藥子及配伍當(dāng)歸后含藥血清體外的抗腫瘤作用研究

1、黃藥子及配伍當(dāng)歸后含藥血清體外的抗腫瘤作用研究崔立然1，索晴2，劉樹民2，楊婷婷2，劉學(xué)偉21 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，齊齊哈爾 (161041)2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 (150040)E-mail：摘 要：目的：研究黃藥子及黃藥子配伍當(dāng)歸后的含藥血清體外抗腫瘤作用。方法：采用MTT法來檢測黃藥子及黃藥子配伍當(dāng)歸后的含藥血清對肉瘤細(xì)胞（S180）和肝癌細(xì)胞（H22）增殖的抑制作用，用熒光分光光度法檢測該用藥后兩種癌細(xì)胞的P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)，結(jié)果：當(dāng)歸可提高黃藥子對兩種癌細(xì)胞的抑制率，同時可降低P-gp的表達(dá)。結(jié)論：黃藥子配伍當(dāng)歸后可通過降低P-gp 的表達(dá)增加黃

2、藥子抗腫瘤作用。關(guān)鍵詞：黃藥子，當(dāng)歸，S180，H22，血清藥理學(xué)中圖分類號：R281引言黃藥子為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨(dú)（Dioscorea bulbifera L.）的塊莖，藥性苦寒，具有散結(jié)消癭、清熱解毒、涼血止血的作用，其有廣泛的藥理活性，可用于癭疾瘤腫等，但其也為肝固有毒物，其毒性嚴(yán)重制約了其在臨床上的卓越療效的發(fā)揮。本研究是在實(shí)驗(yàn)室前期研究12黃藥子的毒性及其配伍當(dāng)歸后減毒機(jī)制基礎(chǔ)上，應(yīng)用MTT法、熒光分光光度法觀察黃藥子配伍當(dāng)歸后含藥血清對腫瘤細(xì)胞的抑制效果，皆在說明其配伍是否具有增效的作用，為中藥的配伍應(yīng)用提供更科學(xué)的依據(jù)。本次實(shí)驗(yàn)前已經(jīng)分別進(jìn)行了體外藥物和含藥血清指紋圖譜系統(tǒng)研究

3、。2. 儀器及試驗(yàn)材料試驗(yàn)藥物：黃藥子購于黑龍江省藥材公司,鑒定為薯蕷科植物黃獨(dú)(Dioscorea bulbifera L. )的塊莖。當(dāng)歸購于黑龍江省藥材公司,鑒定為傘形科植物當(dāng)歸(Angelica sinensis（Oliv.） Diels)的干燥根。黃藥子飲片,頭煎10倍量水,二煎8倍量水浸泡后煎煮2次,合并煎液,濃縮,噴霧干燥制粒,每1 g顆粒相當(dāng)于17. 5g原藥材。用時用蒸餾水溶解稀釋至所需濃度。黃藥子與當(dāng)歸(1: 2) ,依上煎煮制備。（HF90,上海）；超級潔凈工作臺（北京）；倒置顯微鏡（CKX41，Philippines）;儀器：CO2培養(yǎng)箱酶標(biāo)儀（anthos 2010

4、17750,anthos labtec instrument，Austria）；熒光分光光度計(jì)（RF-5000，Japana）；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)（安徽合肥）。動物：雄性SD大鼠，體重200±20g，購于上海斯萊客實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。許可證號：SCXK（滬）（2003-0003）。細(xì)胞：肉瘤細(xì)胞（S180）和肝癌細(xì)胞（H22）（黑龍江省腫瘤研究所提供）。實(shí)驗(yàn)試劑：四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國sigma)；二甲基亞砜(DMSO ，AMRESCO)，RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司產(chǎn)品）；胎牛血清（NBS，杭州四季清公司）；羅丹明123（Rho-123，美國sig

5、ma）。3 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果3.1 含藥血清的制備取雄性SD大鼠15只。分為三組：空白組（灌胃給予生理鹽水），黃藥子組每日ig20g/kg - 1 -（生藥量）黃藥子，黃藥子加當(dāng)歸組（后文簡稱“配伍組”)每日ig 60g/kg（生藥量），連續(xù)3d，末次給藥后1h，取血，離心分離血清，56滅活30min。0.22um微孔濾膜除菌4保存?zhèn)溆谩?.2 MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，濃度為5×104個，在96孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞(100 ul /孔)，每孔6個復(fù)孔。96孔板置37、5%CO飽和濕度培養(yǎng)箱孵育24h后，分別加入含藥血清和空白血清，使其血清終濃度為20%，48h后加入MTT（5m

6、g/ml）10ul，于37，5%CO2培養(yǎng)箱孵育4h后，棄上清，加入DMSO200ul/孔，旋渦震蕩器上震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，與490nm波長處用酶標(biāo)儀測OD值。并按以下公式計(jì)算抑制率。結(jié)果見表一抑制率%=（1-含藥血清組OD值均數(shù)/空白血清組OD值均數(shù)）×100%Tab.1 the inhibition effect of Serum containing drug on S180 and H22（±s，n=6）S180 H22組別 A 抑制率% A 抑制率% 空白血清組 0.799±0.032 0.966±0.022黃藥子組 0.502

7、±0.078 37.18 0.833±0.094 11.90 配伍組 0.435±0.05145.56 0.752±0.085 21.54 Note: P0.01 vs control serum P0.05 P0.01 vs Dioscorea bulbifera L. serum實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃藥子和配伍組的含藥血清對S180和H22增殖有抑制作用，其抑制率分別為37.18% 、45.56%及11.90% 、21.54%，說明配伍后對癌細(xì)胞的抑制率明顯提高。其中H22組雖抑瘤效果不佳，但配伍后也能提高抑制率。表明當(dāng)歸可能通過某種環(huán)節(jié)增強(qiáng)了黃藥子的療效

8、。3.3 P-gp表達(dá)測定取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，濃度為5×104個，加入到96孔板上，每孔加含細(xì)胞的培養(yǎng)液100ul，置37，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h后，分別加入含藥血清和空白血清，使其血清終濃度為20%，與加藥后30min、60min、120min、180min，240min用PBS潤洗預(yù)孵育30 min后加入20ul （30ug/ml）的Rho-123于37，5%CO2培養(yǎng)箱孵育30min后，棄上清以冰冷的PBS洗細(xì)胞數(shù)次除去細(xì)胞外吸附的熒光染料， 細(xì)胞內(nèi)積聚的染料用正丁醇萃取，樣品中的Rho-123熒光強(qiáng)度用熒光分光光度計(jì)測定（Ex=330nm；Em=528 nm）。結(jié)果見

9、圖一，圖二- 2 -6050403020100.5h1h2h3h4hintensityFig. 1 Intracellular Rho-123 in S180 cells for various length of times6050intensity403020100.5h1h2h3h4hFig. 2 Intracellular Rho-123 in H22 cells for various length of times實(shí)驗(yàn)結(jié)果：從圖一、圖二可以顯示各組隨著暴露時間的延長,細(xì)胞內(nèi)蓄積的Rho-123的熒光強(qiáng)度在0.5h到1h吸收最快，并且熒光強(qiáng)度在1h時最大，2h以后呈下降趨勢到3h基本

10、趨于平穩(wěn)，配伍組在1h后明顯大于黃藥子組和空白血清組（P0.05），標(biāo)志細(xì)胞對進(jìn)入胞內(nèi)的Rho-123 的排泌能力下降,P-gp 表達(dá)降低?？瞻籽褰M細(xì)胞熒光強(qiáng)度在1h達(dá)到最大吸收后無明顯變化，而黃藥子組在2h 后熒光強(qiáng)度低于空白血清組（P0.05），標(biāo)志細(xì)胞對進(jìn)入胞內(nèi)的Rho-123 的排泌能力下降,P-gp 表達(dá)升高。4 討論中藥雖成分眾多,但只有那些被消化吸收進(jìn)入血液的成分或其代謝產(chǎn)物才有產(chǎn)生藥效的可能，本實(shí)驗(yàn)采用含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，研究了黃藥子及其配伍當(dāng)歸后的藥效及其可能的機(jī)制，其快速、敏感、條件易控、重現(xiàn)性好，避免中藥制劑直接體外給藥的諸多干擾因素，不但能反映中藥母體藥物及其可能代

11、謝產(chǎn)物的藥理作用，而且還能反映有可能由藥物誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用，結(jié)果顯示S180、H22中P-gp的表達(dá)水平與其MTT體外藥敏試驗(yàn)有較好的相關(guān)性，說明黃藥子配伍當(dāng)歸后增效的一個重要機(jī)理是降低P-gp的表達(dá)，抑制P-gp泵的功能達(dá)到蓄積藥物，增加藥效的作用。P-gp是一種分子量為170kDa的依賴ATP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,是多藥耐藥(MDR)基因的表達(dá)產(chǎn)物,可將多種結(jié)構(gòu)和特性不相關(guān)的外源性和內(nèi)源性對細(xì)胞有潛在毒作用物質(zhì)排出細(xì)胞3。P-gp過度表達(dá)是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的主要原因，P-gp抑制藥可以抑制P-gp對腫瘤藥物的外排作用，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度提高，從而逆轉(zhuǎn)MDR4。本實(shí)驗(yàn)研究表明通過

12、配伍降低P-gp的表達(dá)可以提高黃藥子的抗腫瘤效果，至于黃藥子配伍當(dāng)歸如何影響P-gp，引起- 3 -藥物積聚，可能的因素有基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控，或蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，抑或競爭性抑制，當(dāng)然亦有可能為別構(gòu)效應(yīng)等結(jié)果，有待進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)1 劉樹民，李玉潔，羅明媚 當(dāng)歸對黃藥子的減毒作用J 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2004，14（4）；2162 劉樹民,張琳,李穎黃藥子與當(dāng)歸配伍對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1基因mRNA表達(dá)的影響J中藥藥理與臨床，2006; 22 (3、4)；973 劉志偉， 陳佳琳， 陳秉衡銅對人類腸道上皮Caco-2細(xì)胞的毒性研究J衛(wèi)生研究，2004，33（3）；2844

13、 戚世偉。 P糖蛋白抑制藥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的研究進(jìn)展J 。醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（7）；682Studies on Anti-tumor by serum containing of Compatibility of Dioscorea bulbifera L and Angelica sinensis Diels In vitroCui Liran1，Suo Qing2，Liu Shumin2，Yang Tingting2，Liu Xuewei21 The First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Qiqihar，hei

14、longjiang （161041） 2 Institute of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang University of Traditional ChineseMedicine，Harbin （150040)AbstractObjective： To explore the inhibition effect of the inhibition effect of Serum containing drug on tumor. Methods： The effect of Serum containing drug on S180 and H22 were analyzed with MTT assay. The expression of P-glycoprotein was detected with Fluorescence Spectrophotometry before and after Compatibility.Results： inhibition effect can be increased after compatibility, the expression of P-gp could be decreased significantly a