神經病理性疼痛大鼠脊髓背角神經型一氧化氮合酶表達的

1、神經病理性疼痛大鼠脊髓背角神經型一氧化氮合酶表達的多樣性和相應亞型對神經病理性疼痛大鼠脊髓背角神經型一氧化氮合酶表達的多樣性和相應亞型對PC12PC12 細胞細胞 NF-kappa B 活性的影響活性的影響（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院麻醉學教研室， 武漢 430030）金小高 羅愛林 王金韜 張廣雄 王賢裕 李亞文 摘要摘要 目的：目的：研究神經病理性疼痛大鼠脊髓背角神經型一氧化氮合酶亞型的表達變化，檢測相應亞型對 NF-kappa B 轉錄活性，探討神經型一氧化氮合酶各亞型的表達變化在致痛機制中的意義。方法：方法：雌性 SD 大鼠 20 只，體重150200g，隨機分為 2 組（n=

2、10） ，對照組和 SNI 組。 SNI 組于左肢制備坐骨神經保留性神經損傷模型（SNI） ，對照組實施假手術。手術前后測定大鼠對機械刺激產生縮腿反應的次數。術后 11d 痛覺測定后，每組取 3 只大鼠用于灌注，應用免疫組織化學方法檢測脊髓 nNOS 的表達。7 只大鼠斷頭處死后分離 L4-6脊髓，提取其中 3 只大鼠脊髓的蛋白質，應用抗 nNOS 羧基端抗體和 Western Blot 方法檢測 nNOS 的表達，提取其中 4 只大鼠脊髓的 RNA，1 只大鼠脊髓 RNA進行 RACE-PCR 和 Southern Blot 實驗檢測 nNOS 不同的 mRNA；余下 3 只大鼠脊髓的 RN

3、A 用于檢測 nNOS 的 mRNA 變化。將攜帶 nNOS 或 nNOS 基因的 pcDNA3.0表達質粒通過脂質體轉染 PC12 細胞后，提取經篩選 PC12 細胞的核蛋白，采用EMSA 凝膠電泳阻滯實驗檢測細胞核 NF-kappa B 轉錄活性。結果：結果：SNI 組術后3d 機械刺激術側后爪引起縮腿反應的次數高于對照組（P0.05） 。nNOS 主要表達于脊髓背角的層和層。Western Blot 結果顯示有三種分子量的 nNOS表達，分別位于 155、135 和 125KD 左右，155KD 的 nNOS 表達的相對灰度 SNI組高于對照組（P0.05） ；135KD 的 nNOS

4、表達的相對灰度 SNI 組高于對照組（P0.05） 。RACE-PCR 和 Southern Blot 實驗證實有三種 nNOS（nNOS、 和 ）的 mRNA 表達。PCR 結果顯示存在 nNOS、nNOS 的 mRNA。PC12 細胞轉染 nNOS 后增加NF-kappa B 轉錄活性（P0.05） ，而 nNOS 降低 NF-kappa B 轉錄活性（P0.05） ；結論：結論：大鼠脊髓背角有三種神經型一氧化氮合酶（nNOS、 和）表達；神經病理性疼痛時 nNOS 表達升高，而 nNOS 降低；由于結構不同，nNOS 增加 PC12 細胞 NF-kappa B 轉錄活性，nNOS 則降低

5、其活性；可能與疼痛的機制有關。因此可以認為神經病理性疼痛大鼠脊髓背角 nNOS 和 nNOS 的表達變化可能是致痛機制之一。關鍵詞關鍵詞：神經病理性疼痛；脊髓；神經型一氧化氮合酶；核因子 kappa B The diversities of neural nitric oxide synthase expression in spinal cord of rats with neuropathic pain and their effects on NF-kappa B activity in PC12 cellsXiaogao Jin, Ailin luo*, Ping wang# , Gu

6、angxiong Zhang, Jintao Wang, Yawen Li . *Department of Anesthesiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, P.R.China, 430030; #Department of Anesthesiology, The peoples hospital of Enshi state，Enshi, P.R.China. Abstracts Objective To observe

7、 the diversity and changes of nNOS expression in spinal cord in rat with neuropathic pain, and To determine effects of overexpression of nNOS or nNOS on NF-kappa B activity and apoptosis in PC12 cells. Methods 20 female SD rats (weight ranged from 150 to 200g) were randomized into two groups，control

8、 group and Group SNI. No any injury was taken in control group. Surgery was performed for SNI neuropathic pain model in Group SNI. Foot-lift response frequency to mechanical stimulation for ipsilateral hindpaw was assessed by 12g and 2g touch stimulator. On the 11th day after operation, 3 rats from

9、each group were fixed by perfusion for immunohistochemistry to analyse the expression of nNOS. Protein from L4-6 spinal cord from other 3 rats in each group were detected with an antibody specific for COOH-terminal domain of nNOS using Western blot. Total RNA were extracted from ipsilateral L4-6 spi

10、nal cord in other 4 rats in each group. Rapid amplification of 5-RACE-PCR was performed to identify the diversity of 5terminus of nNOS, then southern blot confirmed them. RT-PCR devised for different 5terminus of nNOS were amplified to further confirm presence of the diversity of nNOS in mRNA level.

11、 PC12 cell was transfected with pcDNA3-nNOS or pcDNA3-nNOS respectively. Then the nuclear translocation of NF-kappa B of PC12 cell was assayed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA).Results: Since the 5th day after operation, all rats in Group SNI developed a relative unchangeable mechanical

12、 allodynia. The expression of nNOS was mainly distributed in neurons in - and lemanie in dorsal horn. Western Blot analysis indicated three kinds of nNOS at 155, 135 and 120 KDa were present in rat spinal cord. The nNOS at 155 KDa in SNI group increased significantly when compared with control group

13、 (P0.05), but vice versa for the nNOS at 135 KDa (P0.05). Rapid amplification of 5cDNA ends-PCR revealed the presence of three different 5-end splices variants of nNOS. RT-PCR confirmed two variants encoded for the nNOS at 155 KDa, one for the nNOS at 135 KDa. PC12 cell Transfected with nNOS gene in

14、creased nuclear translocation of NF-kappa B comparing with null transfectants PC12 cells. But overexpression of nNOS in PC12 cell decreased nuclear translocation of NF-kappa B when compared with null transfectants cells.Conclusion: There are at least two kinds of nNOS protein (weighted at 155 and 13

15、5 KDa, e.g. nNOS and nNOS) expressed in rat spinal cord. The expression of nNOS increased in spinal cord in rats with neuropathic pain, but nNOS decreased. nNOS increase nuclear translocation of NF-kappa B in PC12 cells, but nNOS decreased it. The changes of nNOS and nNOSexpression in spinal cord ma

16、y concern with the mechanism leading to neuropathic pain. Key words: neuropathic pain; spinal cord; neural nitric oxide synthase; nuclear factor kappaB外周神經損傷可導致神經病理性疼痛，神經型一氧化氮合酶（nNOS）在脊髓中發(fā)揮著重要的致痛作用。研究表明1，神經病理性疼痛時，痛覺傳人神經元末梢在脊髓中釋放大量的谷氨酸，谷氨酸通過激活 NMDA 受體提高痛覺轉遞神經元的興奮性，與此同時，經 NMDA 受體內流的 Ca2+激活臨近的nNOS，nNOS

17、 合成的 NO 透過細胞膜彌散致突觸前膜加速谷氨酸的釋放，促進疼痛產生。NMDA 受體和 nNOS 在功能上之所以能夠相互促進，是因為 NMDA 受體亞單位 NR2B 和 nNOS 均具有 PDZ 結構域2； PSD95（PSD95 是一種骨架蛋白，它具有 3 個 PDZ 結構域）通過 PDZ 與 PDZ 的相互作用將含有 PDZ 結構域的 NR2B 和 nNOS 聯系在一起2，這是 nNOS 與 NMDA 受體在功能上具有相互促進作用的結構基礎。近來在小鼠的腦組織中發(fā)現三種不同氨基端的神經型一氧化氮合酶，分別為 nNOS、 和 2-5。nNOS 是全長的 nNOS，其分子量為 155kDa，

18、其氨基端包含一個 PDZ 結構域，可以與突觸后致密物質（PSD95）的 PDZ 結構域相互結合，使得 nNOS 可以位于細胞膜上；而 nNOS 和 的分子量分別為136、125 kDa，它們均不具有氨基端的 PDZ 結構域，不能錨定在細胞膜上與NMDA 受體形成復合物，不能充分利用經 NMDA 受體內流的鈣，它們合成 NO的能力分別是 nNOS 的 80和 3。如上所述，神經病理性疼痛大鼠脊髓中nNOS 對疼痛產生如此重要，并且大鼠和小鼠組織一樣存在多種 nNOS 亞型2-7，但大鼠脊髓中 nNOS 表達的亞型類別以及各類型的表達變化尚不清楚，因此，本研究的目的之一在于明確神經病理性疼痛大鼠脊

19、髓神經型一氧化氮合酶表達的亞型及變化。由于缺乏 PDZ 結構域，部分 nNOS 亞型處于細胞漿中，合成 NO 的能力顯著下降。PDZ 結構域不僅對 nNOS 亞型合成 NO 的能力有重要影響，而且可能對 NMDA 受體的功能有重要的調節(jié)作用。研究表明 nNOS 生產的 NO 可以亞硝基化 NMDA 受體的巰基，改變 NMDA 受體的結構，減少鈣離子的內流8；也有研究表明：在肌萎縮性側束硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的運動神經元中神經絲相互聚集，聚集的神經絲將 nNOS 包裹在胞漿中，nNOS不能對細胞膜上的 NMDA 受體產生反饋性抑制作用，NMD

20、A 受體活性增強，導致運動神經元受損9。由此可以推測，如果 nNOS 亞型缺乏 PDZ 結構域而位于細胞漿，那么將失去對 NMDA 受體的調節(jié)功能。介于 PDZ 結構域對 nNOS亞型的功能有如此重要影響，本實驗在明確 nNOS 各亞型表達及變化的基礎上，將選擇相應的亞型研究它們在功能上的差異。研究表明，組成型 NOS（nNOS和 eNOS）合成的 NO 通過亞硝基化 NF-kappa B 的巰基，破壞其構形，可以抑制 NF-kappa B 的轉錄活性8；但研究也顯示 NO 具有促進 NF-kappa B 轉錄活性的作用8；由此可以推測，不同亞型的 nNOS 可能對 NF-kappa B 轉錄

21、活性產生不同的影響。研究還顯示神經病理性疼痛脊髓中 NF-kappa B 轉錄活性加強，增加 nNOS 和 COX-2 的表達，提高了痛覺傳遞神經元的興奮性，促進疼痛產生10-11。所以，本實驗的另一目的在于選擇 NF-kappa B 轉錄活性來研究 nNOS 亞型功能的差異，探討不同 nNOS 亞型在神經病理性疼痛大鼠脊髓中的致痛機制。1 材料與方法材料與方法1.11.1 分組和模型制備分組和模型制備 雌性 SD 大鼠 20 只，體重 150200g，月齡 2 個月 （華中科技大學同濟醫(yī)學院動物飼養(yǎng)中心） ，隨機分為 2 組(n=6)，對照組于大鼠左肢暴露坐骨神經后，隨即縫合切口；SNI 組

22、用于制備坐骨神經保留性神經損傷模型（SNI） ，暴露大鼠左后肢坐骨神經主干及其分支（脛神經、腓腸神經、腓總神經） ，結扎并切斷脛神經、腓總神經，保留腓腸神經，縫合手術切口。1.21.2 痛覺測定痛覺測定 使用動態(tài)足底觸覺測量儀（Ugo basile 公司生產，意大利）測定大鼠對機械刺激的反應，12g 和 2g 力度的接觸刺激分別代表痛覺過敏和痛覺異常，每個力度共刺激大鼠術側后爪足底外側 30 次，分三次實驗，每次刺激10 次，間隔 10min 后再重復實驗 ，計算總的縮腿反應次數。分別于術前 3d、術后即刻、術后 1、3、5、7、9、11d 測定大鼠對機械刺激產生縮腿反應的次數。1.31.3

23、免疫熒光雙標方法測定脊髓免疫熒光雙標方法測定脊髓 nNOSnNOS 和和 NeuNNeuN 的表達的表達 術后 11d 測痛后，兩組各取大鼠 3 只，10%水合氯醛 600mg/kg 麻醉后，4%多聚甲醛灌注大鼠，分離脊髓，截取 L4-6脊髓，經多聚甲醛后固定，蔗糖脫水后，冰凍冠狀切片（30m） ，收集切片于 0.01mmol/L 的 PBS 中，應用漂片法進行免疫熒光組化實驗，使用抗nNOS 梭基端抗體（北京中山公司）檢測 nNOS 的表達。切片經 0.01 molL-1 PBS 漂洗 10min 后滴加羊血清孵育 30min,勿洗，加兔抗 nNOS (1: 300, R&D),4c

24、 過夜；PBS 沖洗，3minx3 次，滴加 TRITC 標記山羊抗兔 IgG 熒光二抗，室溫孵育 1h, PBS 沖洗，3minx3 次；再用羊血清孵育 30min, 滴加鼠抗 NeuN(1: 500, Santa Cruz), 4c 過夜；PBS 沖洗，3minx3 次，滴加 FITC 標記山羊抗鼠IgG 熒光二抗，室溫孵育 1h, PBS 沖洗，3minx3 次。甘油封片，熒光顯微鏡觀察雙標結果。1.41.4 WesternWestern BlotBlot 方法檢測脊髓方法檢測脊髓 nNOSnNOS 的表達的表達 術后 11d 測痛后，兩組各取大鼠3 只，斷頭處死，迅速分離 L4-6脊髓

25、，加入 2 倍 L4-6脊髓體積的懸浮緩沖液（0.1mol/L NaCl、0.01mol/L Tris.Cl、0.001mol/L EDTA、1g/ml Aprotinin、100g/ml 苯甲基磺酰氟） ，4勻漿器中勻漿。勻漿后于 4低溫離心機 12000 轉/min 離心 45min，吸取上清液，采用考馬斯亮藍 G250 法蛋白定量。灌制 8SDS-PAGE 凝膠，每孔上樣量 50g，在 65V 穩(wěn)壓電場中電泳。電泳后應用 380mA 電流將蛋白從 SDS-PAGE 凝膠轉移至硝酸纖維素濾膜。硝酸纖維素濾膜經 5脫脂奶粉封閉后，依次與兔抗鼠 nNOS 抗體、羊抗兔二抗孵育后，DAB 顯色。

26、1.51.5 5 5-RACE-PCR-RACE-PCR 和和 SouthernSouthern BlotBlot 方法測定脊髓方法測定脊髓 nNOSmRNAnNOSmRNA 的多樣性的多樣性 術后 11d測痛后，兩組各取大鼠 3 只，斷頭處死，迅速分離 L4-6脊髓，使用 Trizol（北京中山公司）提取總 RNA。5-RACE-PCR 的試劑和方法均來自 BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD 公司，美國)。取 2g 總 RNA421.5h 合成第一條 cDNA 鏈。合成第一條 cDNA 鏈 2.5l、nNOS 特異性反義引物 5-TCTCCTT

27、GTTTCANCTCCTCC-3（上海生物工程有限公司合成）1pmol、通用混合引物（5-CTAATACGACTCTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3和 5- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3）5l 按照試劑盒說明采用降度 PCR 技術快速擴增5 cDNA 端，PCR 具體方法為 9450s、6245s、723min、循環(huán) 5 次，每次降低退火溫度 2，然后 9445s、5645s、723min、循環(huán) 32 次。PCR 產物于1.25%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下拍照保存6。利用毛細管的抽吸作用將瓊脂糖凝膠中的 PCR 產物轉移至尼龍膜上， DNA

28、5 END-Labeling System（Promega 公司，美國）標記 32ATP（北京福瑞生物公司）于 5-TCTGGCTTCCGCGTGTGC-3 ，將尼龍膜與 1pmol 標記32P的 nNOS 引物 38共孵育 12h。尼龍膜漂洗干燥后，與 X 光片一起置于70下 12h 以獲得放射性自顯影影像。1.61.6 RT-PCRRT-PCR 法檢測法檢測 nNOSanNOSa、nNOSbnNOSb 的轉的轉錄錄。兩組取另外 3 只大鼠，斷頭處死，提取左側 L4-6段脊髓 RNA。每一個樣品取 4g RNA 進行逆轉錄后，各取 2l 進行 PCR 反應。nNOS-a 與 nNOS 的上游

29、引物為 5- ggt gag cca ggt tgt gc -3， 下游引物為 5- ctt ctc tga ata cgg gtt gtt a -3（上海生物工程有限公司合成） ，合成的 DNA 片段分別為 1478bp 和 392bp；nNOS-b 的上游引物為 5- gactgagggcgacactaccatgc -3， 下游引物為 5- tcgggggcagcaacgggatgtgtc -3， 合成的 DNA 片段為 208bp；-actin 上游引物為 5- AAGATTTGGC ACCACACTTTCTAC -3， 下游引物為 5- ACACTTCATGATGGAATTGAATGT

30、 -3， 合成的 DNA 片段為 605bp。PCR 的條件為943min 預變性，9430s、5045s、722min，循環(huán)次數為 38 次，PCR 產物于 1.25%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測電泳條帶的灰度。1.7 PC12 細胞轉染細胞轉染 nNOS 亞型后亞型后 NF-kappa B 的活性變化的活性變化 PC12 細胞采用DMEM/F12 培養(yǎng)基、150g/L 胎牛血清于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。在PC12 細胞覆蓋培養(yǎng)瓶達到 90左右時，使用脂質體將攜帶 nNOS 或 nNOS基因的 pcDNA3.0 質粒（德國 Saur 教授贈送7）轉染 PC12 細胞，培養(yǎng) 12 天后，經 G

31、418 篩選 23wk，得到高表達 nNOS 或 nNOS 的 PC12 細胞，Western Blot 檢測細胞漿 nNOS 的表達效率。收集未轉染、轉染 nNOS 或nNOS 基因的 PC12 細胞，1500r/min 離心后，使用 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents 試劑盒提取細胞核蛋白，考馬斯亮藍 G250 法蛋白定量，80儲存?zhèn)溆?。分別取未轉染、轉染 nNOS 或 nNOS 基因的 PC12細胞細胞核蛋白 20g，分別與 32P 標記的 NF-kappa B 結合系列 5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC

32、 AGG C-3(雙鏈)共孵育 1h。灌制 20g/L SDS-PAGE 凝膠，分別加入上述混合物，在溴酚藍指示下 150V 電泳。電泳完成后，應用同樣大小的濾紙貼附在凝膠上，小心剝離凝膠，將濾紙和凝膠一同干燥，讓濾紙完全干在濾紙上，把濾紙和 X 光片一起置于70下 12h 以獲得放射性自顯影影像。1.81.8 統計學處理統計學處理 用 SPSS11.0 統計軟件分析。計量資料以均數標準差（s）表示 ，組間采用獨立樣本t檢驗；P0.05 為差異具有統計學意義。2 結果結果2.12.1 痛覺測定痛覺測定 12 和 2g 力度的接觸刺激引起 SNI 組縮腿反應的次數在術后 3 日后各時點均高于對照

33、組（P0.05） ，對照組手術前后各時點比較差異無統計學意義（P0.05） ，見圖 1，2。與對照組比較，*P0.05圖 1 12g 力度刺激術側后爪 30 次引起兩組大鼠不同時點縮腿反應次數的比較與對照組比較，*P0.05圖 2 2g 力度刺激術側后爪 30 次引起兩組大鼠不同時點縮腿反應次數的比較2.22.2 免疫組化免疫組化 nNOS 主要表達在脊髓背角-層和層；在背角層 nNOS的表達呈帶狀分布,細胞形態(tài)不清楚，、和層表達 nNOS 的細胞形態(tài)清楚，呈散在分布；表達 nNOS 的細胞與神經元（表達神經元標記物 Neuro）基本重合（圖 3） ，但對照組與 SNI 組 nNOS 表達灰度

34、差異沒有差異無統計學意義。 圖 3 大鼠脊髓表達 nNOS 和 Neuro 的狀況（100 倍）（A、B 和 C 均為同一脊髓背角，分別為表達 nNOS、NeuN 和重合的情況；D、E 和 F 均為同一中央孔附近區(qū)域，分別為表達 nNOS、NeuN 和重合的情況）2.32.3 脊髓中脊髓中 nNOSnNOS 表達表達 WesternWestern BlotBlot 結果結果 對照組和 SNI 組有三種不同分子量的nNOS 表達，分子量分別為 155、135 和 120KDa(圖 4)；SNI 組 155 KDa nNOS 的相對表達量（nNOS 與 -actin 表達灰度的比值）高于對照組（P

35、0.05） ，而135KDa nNOS 相對表達量低于對照組（P0.05） 。圖 4 對照組和 SNI 組脊髓表達 nNOS 的 Western Blot 結果2.42.4 RACE-PCRRACE-PCR 和和 SouthernSouthern BlotBlot 結果結果 針對 nNOS 氨基端的 RACE-PCR 結果電泳條帶不清楚；電泳條帶的 Southern Blot 結果顯示對照組和 SNI 組脊髓中均有三種不同分子量的 DNA 條帶，分別大約為 300、750 和 1250bp(圖 5)。 圖 5 對照組和 SNI 組脊髓中 nNOS 的 RACE-PCR 和 Southern B

36、lot 結果（A 為 RACE-PCR，B 為 Southern Blot 結果）2.52.5 PCRPCR 結果結果 對照組和 SNI 組脊髓中 -actin 的 PCR 結果顯示 -actin 片段位于大約 600bp 處；針對 nNOS-a 的 PCR 結果顯示于 450bp 和 1500bp 處各有一種片段，分別定為 nNOS-a 和其剪結體 nNOS；關于 nNOS-b 的 PCR 結果顯示 nNOS 片段大約位于 150bp 處（圖 6） 。圖 6 對照組和 SNI 組脊髓中針對-actin、nNOS-a 和 nNOS-b PCR 產物電泳結果（A 為-actin，B 為 nNOS

37、-a，C 為 nNOS-b）2.6 Western Blot 結果結果 未轉染、轉染 nNOS 和 nNOS 基因的 PC12 細胞有三種不同分子量的 nNOS 表達，分子量分別為 155000、135000 和 120000；PC12細胞未轉染、轉染 nNOS 和 nNOS 基因后分子量為 155000 的 nNOS 相對表達量（nNOS 與 -actin 表達灰度的比值）分別為 0.580.06、1.500.23 和0.910.08, 細胞轉染 nNOS 后分子量為 155000 的 nNOS 相對表達量高于未轉染和轉染 nNOS 基因（P0.05） ； PC12 細胞未轉染、轉染 nNO

38、S 和 nNOS基因后分子量為 135000 的 nNOS 相對表達量分別為 0.490.04、0.520.14 和0.870.09,轉染 nNOS 基因后分子量為 135000 的 nNOS 相對表達量高于未轉染和轉染 nNOS 基因的 PC12 細胞（P0.05） 。見圖 7。圖 7 PC12 細胞未轉染、轉染 nNOS 或 nNOS 基因后 nNOS 表達的 Western Blot 結果（1、2 和 3 分別為未轉染、轉染 nNOS 或 nNOS 基因的 PC12 細胞）2.7 凝膠電泳阻滯實驗（凝膠電泳阻滯實驗（EMSA）結果）結果 EMSA 獲得放射性自顯影影像的灰度表示細胞核內

39、NF-kappa B 的量，間接顯示 NF-kappa B 的轉錄活性，具體見圖 8。未轉染、轉染 nNOS 或 nNOS 基因的 PC12 核內 NF-kappa B 的 EMSA 灰度分別為 18.301.4、26.45.0 和 8.90.7（104INT） ，轉染 nNOS 基因的 PC12 細胞 NF-kappa B 的轉錄活性高于未轉染基因的 PC12 細胞（P0.05） ，而轉染nNOS 基因的 PC12 細胞 NF-kappa B 的轉錄活性低于未轉染基因的 PC12 細胞（P0.05） 。圖 8 PC12 細胞未轉染、轉染 nNOS、nNOS 基因后檢測細胞核 NF-kappa

40、 B 的 EMSA 結果（1、2 和 3 分別為未轉染、轉染 nNOS 或 nNOS 基因的 PC12 細胞）3 3 討論討論神經損傷所導致的痛覺異?；蛲从X過敏稱為神經病理性疼痛，神經病理性疼痛的機制尚不清楚。研究神經病理性疼痛的機制有多種模型供選擇，本研究之所以選擇坐骨神經保留性神經損傷模型（SNI） ，是因為該模型相對于 CCI 或SNL 模型操作簡單、產生疼痛需要的時間短、疼痛程度的個體差異性小。本研究 SNI 模型大鼠術后 3d 就可以在術側后爪產生明顯的痛覺異常和痛覺過敏，術后 5d 痛覺的改變趨于穩(wěn)定；在 11d 取材，大鼠痛覺穩(wěn)定，脊髓中基因轉錄、蛋白表達產生明顯而穩(wěn)定的變化，便

41、于比較它們的變化。制作 SNI 模型是在暴露大鼠左后肢坐骨神經主干及其分支（脛神經、腓腸神經、腓總神經）后，結扎并切斷脛神經、腓總神經，保留腓腸神經；坐骨神經在脊髓對應的節(jié)段為 L46，所以本研究取材選擇 L46段脊髓，能夠反應外周神經損傷導致痛覺過敏后脊髓中 nNOS 表達變化。衡量機械刺激誘導大鼠疼痛反應程度最常用的方法是測定 50縮爪閾值，但測定 50縮爪閾值的過程復雜、計算繁瑣，不能直觀地反應疼痛的變化。本研究采用 12g 和 2g 力度的接觸刺激分別代表痛覺過敏和痛覺異常，每個力度共刺激大鼠術側后爪足底外側 30 次，計算總的縮腿反應次數，該方法操作簡單，不需要計算，容易理解。免疫組

42、織化學結果顯示 nNOS 主要分布于脊髓背角，神經病理性疼痛時脊髓背角的 nNOS 升高，在神經元中 nNOS 位于細胞膜和細胞漿。免疫組織化學可以清楚地顯示 nNOS 表達的位置變化，但反應 nNOS 表達的數量變化不如 Western Blot。Western Blot 結果發(fā)現有三種不同分子量的 nNOS 的表達，其分子量分別為 155、130 和 125KD 左右。其中最有意義的就是 155 和 130KD 的 nNOS，它們在神經病理性疼痛中不僅發(fā)生了顯著變化，而且它們的變化方向恰恰相反。這三種分子量的 nNOS 與文獻報道的 nNOS、 和 的分子量大致相同，單單從 Western

43、 Blot 不能推斷它們是否一一對應。為了進一步驗證是由不同 mRNA 翻譯而來還是由同一種蛋白降解而來，本研究在 Western Blot 實驗之后進行了關于 nNOS 的 5RACE-PCR 實驗。5RACE-PCR 結果發(fā)現 SNI 組和對照組大鼠均有數種不同的 mRNA 表達，但條帶不甚清楚。為了準確顯示 mRNA 表達的不同，本研究在 5RACE-PCR 結果的基礎上，應用P32標記的 nNOS 特異性 DNA 序列與 5RACE-PCR 電泳產物雜交，放射性自顯影成像后清晰顯示有三種不同的條帶，分別處于 300、750 和 1250bp 的位置上。這三種不同的 mRNA 能否均翻譯

44、成三種不同的蛋白質，并與 Western Blot 結果中的三種不同分子量的 nNOS 相對應，至此尚不能確定。因為文獻報道 nNOS 有多種不同的 mRNA，能夠翻譯為的 nNOS 有三種 mRNA，分別為 nNOS-a、nNOS-b 和 nNOS-c，它們的第一個外顯子 exon1 不同，分別為 exon1a、exon1b 和exon1c，但這三種 mRNA 只翻譯為一種蛋白質 nNOS,但可能對翻譯的效率有影響4。本研究顯示 RACE-PCR 的三條帶可能分別為 nNOS-a、nNOS-b 和 nNOS三種 mRNA。為了確定脊髓的中有無 nNOSa、nNOSb 和 nNOS 三種 mR

45、NA，本研究根據nNOS-a、nNOS-b 和 nNOS 設計了相應引物進行 PCR 實驗，見圖 7。結合Western Blot 結果，本研究可以推斷脊髓中至少有三種不同 mRNA 的 nNOS 轉錄，按核苷酸數目大小依次為 nNOSa、nNOSb 和 nNOS，nNOSa、nNOSb 翻譯后對應Western Blot 條帶 155KD 的 nNOS，nNOS 翻譯后對應 Western Blot 結果135KD 的 nNOS。而 Western Blot 結果 125KD 在本研究中沒有發(fā)現相對應的mRNA，這有兩種可能，其一：5RACE-PCR 實驗中設計的 nNOS 引物過于靠近5

46、mRNA 端，沒有擴增到較短的 nNOS；其二：125KD 的 nNOS 或 nNOS 由nNOS 或 nNOS 降解得到。所幸的是，125KD 的 nNOS 在神經病理性疼痛時變化不大，而最有意義是 nNOS 和 nNOS 在轉錄和翻譯水平均發(fā)生了相反的變化。nNOS 是 nNOS-b 轉錄后通過剪切拼結而來。相對于 nNOS，nNOS 缺少exon2, exon2 編碼 nNOS 氨基端的 PDZ 結構域2，nNOS、細胞骨架蛋白PSD95、NMDA 受體的 PDZ 結構域通過相互作用在結構上聯合在一起9，nNOS 與NMDA 受體進而在功能上具有相互調節(jié)作用2-7。通過 PSD95，NM

47、DA 受體可以促進 nNOS 合成 NO 的功能，nNOS 反過來可以調節(jié) NMDA 受體活性；而 nNOS由于缺失 PDZ 結構域對 NMDA 受體依存性和調節(jié)功能減低。研究顯示，NMDA 受體與 nNOS 在脊髓中可以相互促進神經病理性疼痛的產生；本研究也顯示與NMDA 受體聯系緊密的 nNOS 表達升高；所以，nNOS 可能在神經病理性疼痛大鼠脊髓起到促進疼痛的作用。而 nNOS 沒有 PDZ 結構域，不能在細胞膜上與 NMDA 受體相聯系，處于細胞漿的 nNOS 表達減少，這種變化是促進還是抑制疼痛的產生尚不得而知。本研究為了探討脊髓 nNOS 和 nNOS 在表達變化相反、分子結構不

48、同上對神經病理性疼痛的影響，選擇從功能上研究它們的差異性，NF-kappa B 成為最合適的研究對象。為證明 nNOS 對 PC12 細胞 NF-kappa B 轉錄活性的影響，本研究提取了細胞核內的蛋白用于 NF-kappa B 的 EMSA 檢測，因為只有細胞核內的 NF-kappa B 才能夠與 DNA 特異系列結合，發(fā)揮轉錄活性。EMSA 測定NF-kappa B 轉錄活性的原理是利用 NF-kappa B 與 DNA 特異系列結合后，分子量增加，在凝膠上電泳速度減慢，通過P32標記的 DNA 特異系列得到放射性自顯影。本研究結果顯示 nNOS 促進 NF-kappa B 轉錄活性，而

49、 nNOS 降低 NF-kappa B 轉錄活性。nNOS 可能利用通過 NMDA 受體內流的鈣離子迅速激活，彌散致突觸前促進谷氨酸釋放，進一步激活 nNOS，大量內流的鈣離子進而得以激活 NF-kappa B 向核內轉移，增加其轉錄活性。而位于細胞漿12中的 nNOS 則可以與NF-kappa B 接近，合成的 NO 得以作用于 NF-kappa B。有研究表明 NO 可以亞硝基化 NF-kappa B 的巰基，改變其構像，降低 NF-kappa B 的轉錄活性。本研究 nNOS 降低 NF-kappa B 轉錄活性可能與此有關。神經病理性疼痛脊髓中 NF-kappa B 轉錄活性加強，增加

50、 nNOS 和 COX-2的表達，提高了痛覺傳遞神經元的興奮性，促進疼痛產生。本研究顯示，神經病理性疼痛大鼠脊髓中 nNOS 表達升高，nNOS 表達減少； nNOS 促進 NF-kappa B 轉錄活性，而 nNOS 由于結構缺失而降低 NF-kappa B 轉錄活性；所以，初步推測神經病理性疼痛大鼠脊髓中 nNOS 亞型 nNOS 和 nNOS 的表達變化可能促進了疼痛的產生。綜上所述，神經病理性疼痛時大鼠脊髓 nNOS 表達升高，nNOS 表達減少；nNOS 是全長的 nNOS，位于細胞膜，而 nNOS 由于缺乏 PDZ 結構域不能和NMDA 受體銜接，處于細胞漿；由于結構不同，nNOS

51、 促進 NF-kappa B 轉錄活性，而 nNOS 降低其活性；介于 NF-kappa B 在神經病理性疼痛中發(fā)揮的重要作用，因此，可以推斷 nNOS 表達升高、而 nNOS 降低是神經病理性疼痛的機制之一。nNOS 與 nNOS 都屬于 nNOS，但由于結構差異導致功能截然相反，研究針對它們的藥物來治療神經病理性疼痛是一個值得探討的方向。參考文獻參考文獻1.Kawamata T, Omote K. Activation of spinal N-methyl-D-aspartate receptors stimulates a nitric oxide/cyclic guanosine 3,

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