放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產(chǎn)物的提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、放線菌抗生素得發(fā)酵及目得產(chǎn)物得提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉掌握土壤中分離抗生素及培養(yǎng)方法2、了解與掌握種子制備與搖瓶發(fā)酵技術(shù)與方法3、了解抗生素發(fā)酵得一般規(guī)律與代謝調(diào)控理論4、 了解小型發(fā)酵罐得基本結(jié)構(gòu)5、熟悉掌握小型發(fā)酵罐得使用方法與保養(yǎng)6、掌握抗生素生物效價(jià)測定得原理與方法；7 .掌握管碟法測定抗生素生物效價(jià)相關(guān)得操作方法。8 .掌握放線菌次級代謝物得初步純化及牛津杯實(shí)驗(yàn)得基本原理與操作技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵罐就是進(jìn)行液體發(fā)酵得特殊設(shè)備、生產(chǎn)上使用得發(fā)酵罐容積大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供實(shí)驗(yàn)室使用得小型發(fā)酵罐，其容積可從約1L至數(shù)百升或稍大些。一般來說，5L以下就是用耐壓玻璃制作罐體,5L以上

2、用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發(fā)酵罐配備有控制器與各種電極，可以自動地調(diào)控試驗(yàn)所需要得培養(yǎng)條件，就是微生物學(xué)、遺傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等科學(xué)研究所必需得設(shè)備?？股?antibiotics)就是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生得具有抗病原體或其它活性得一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其她生活細(xì)胞發(fā)育功能得化學(xué)物質(zhì)、現(xiàn)臨床常用得抗生素有轉(zhuǎn)基因工程菌培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成得化合物放線菌發(fā)酵結(jié)束后，次級代謝物可能與菌體結(jié)合，工業(yè)上常采用草酸或磷酸等酸化劑處理，釋放與菌體結(jié)合得次級代謝物，并采用加熱發(fā)酵液70C,2min使蛋白凝固，所得酸性濾液，在經(jīng)堿處理，進(jìn)一步去

3、除蛋白?？股氐眯r(jià)常采用彳生物學(xué)方法測定，它就是利用抗生素對特定得微生物具有抗菌活性得原理來測定抗生素效價(jià)得方法，如管碟法。管碟法就是目前抗生素效價(jià)測定得國際通用方法，我國藥典也采用此法。管碟法就是根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中得擴(kuò)散滲透作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與檢品兩者對試驗(yàn)菌得抑菌圈大小來測定供試品得效價(jià)。管碟法得基本原理就是在含有高度敏感性試驗(yàn)菌得瓊脂平板上放置小鋼管（內(nèi)徑6.0±0、lmm，外徑8o0±0.lmn，高10±0.lmm）,管內(nèi)放入標(biāo)準(zhǔn)品與檢品得溶液，經(jīng)1618小時(shí)恒溫培養(yǎng)，當(dāng)抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴(kuò)散時(shí)，會形成抗生素濃度由高到低得自然梯度，即擴(kuò)散中心濃

4、度高而邊緣濃度低、因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到或高于MIC（最低抑制濃度）時(shí),試驗(yàn)菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明得無菌生長得區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。根據(jù)擴(kuò)散定律得推導(dǎo)，抗生素總量得對數(shù)值與抑菌圈直徑得平方成線性關(guān)系，比較抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與檢品得抑菌圈大小，可計(jì)算出抗生素得效價(jià)。常用得管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經(jīng)列入藥典、二劑量法系將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品各稀釋成一定濃度比例（2:1或4:1）得兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根據(jù)抗生素濃度對數(shù)與抑菌圈直徑成直線關(guān)系得原理來計(jì)算供試品效價(jià)。取含菌層得雙層平板培養(yǎng)基,每個(gè)平板表面放置4個(gè)小鋼管,管內(nèi)分別放入供試品高、低劑量

5、與標(biāo)準(zhǔn)品高、低劑量溶液、先測量出四點(diǎn)得抑菌圈直徑,按下列公式計(jì)算出檢品得效價(jià)。(1)求出WWV:W=(SH+UH)-(SL+UL)(式2、10-1)V=(UH+LL)-(SH+SL)(式2、10-2)式中：UH:供試品高劑量之抑菌圈直徑；UL:供試品低劑量之抑菌圈直徑；SH:標(biāo)準(zhǔn)品高劑量之抑菌圈直徑;SL:標(biāo)準(zhǔn)品低劑量之抑菌圈直徑；(2)求出0:0=Dantilog(IV/W)(式2、10-3)式中：0:供試品與標(biāo)準(zhǔn)品得效價(jià)比；D:標(biāo)準(zhǔn)品高劑量與供試品高劑量之比,一般為1I:高低劑量之比得對數(shù)，即log2或log4。求出Pr:Pr=Arx0(式2。10-4)式中:Pr:供試品實(shí)際單位數(shù);Ar:

6、供試品標(biāo)示量或估計(jì)單位甲醛滴定法測定氨基氮含量:水溶液中得氨基酸為兩性離子,因而不能直接用堿滴定氨基酸得竣基。用甲醛處理氨基酸，甲醛與氨基結(jié)合,可形成羥甲基衍生物，使NH3+上得H+游離出來，這樣就可用堿滴定NH3+放出得H+,從而計(jì)算出氨基氮含量。如樣品中只含有某一種已知氨基酸，由甲醛滴定得結(jié)果即可算出氨基氮得含量。如果樣品就是多種氨基酸得混合物（如蛋白質(zhì)水解物）,則滴定結(jié)果不能作為氨基酸得定量依據(jù)。甲醛滴定法常用于測定蛋白質(zhì)得水解程度，隨著水解程度得增加，滴定值增加，當(dāng)水解完全后，滴定值保持恒定。甲基紅得變色范圍就是PH4.46.2,意思就是說：1.其pH值在4。46、2區(qū)間時(shí)，呈橙色，2

7、。其pH值至4.4時(shí)，呈紅色，因就是靠近酸性強(qiáng)得一邊時(shí)得顏色，故又稱之為酸色、3.其pH值三6、2時(shí)，呈黃色，因就是靠近堿性強(qiáng)得一邊時(shí)得顏色，故又稱之為堿色二、儀器與材料（一）培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0gNaCl0。5gKNO31、0gK2HPO0、5gMgSQ.7H2O0、5gFeSO4。7H2O0、01g蒸儲水1000ml,PH7。4,發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：淀粉3%,葡萄糖2%,黃豆餅粉2。5%,蛋白月東0。5%,酵母粉0。5%,MgSO40。1%,(NH4)2SO40。3%,KH2PO4,0、03%,CaCO30。4%,PH6、0。黃豆餅粉4g,淀粉10g,酵母粉0、25g,蛋白月

8、東1。5g,MgSO40.025g,CaCO30。4g,(NH4)2SO40.3g,%淀粉酶(105u/ml)0、01ml。100mlPH7047、6可溶性淀粉2.0g,NaClO005g,KNO30。1g,K2HPO40。05g,MgSO4.7H2O0、05g,FeSO47H2O0、001g,加蒸儲水至100ml,PH7.4,牛肉膏蛋白陳牛肉膏（5。0g）,蛋白陳（10、0g）,NaCl（5g）,蒸儲水（10O0mL）,pH7、27、4發(fā)酵罐培養(yǎng)基（2L）:黃豆餅粉80g淀粉200 g酵母粉蛋白月東 30gM gSO0、5 gCaCQ 8g(NH4)2SO4?一淀粉酶（105u/ml）0、2

9、ml（二）流加補(bǔ)料碳源:葡萄糖（1 0%）3 0 0 ml,控制1%;20 0 0*1 %=20 g ,200ml氮源：硫酸鏤（10%）250ml，控制16%調(diào) PH1: 0 .1MHC l0。 1 MNaOH（三）分析指標(biāo)及方法所用試劑及溶液測殘?zhí)且籇NSfe1、 3,5二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）:將6。3g得3,5二硝基水楊酸與2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸鉀鈉得熱水溶液中，再加5g結(jié)晶苯酚與5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸儲水定容到1000ml2、 1。0mg/m1葡萄糖溶液：稱取1g葡萄糖，加蒸儲水定容到1L。3、 6mo1/1氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉24

10、g,加蒸儲水定容到100ml。4、 6mol/l得鹽酸:取濃鹽酸49、68ml,加蒸儲水定容到1 00ml。測殘氮得方法甲醛法1。 甲基紅:0、1g甲基紅，用95%乙醇定容100ml、2。 003moi/LHCL:取濃鹽酸2。48ml,加蒸儲水定容到100ml。3。 0、02858mol/LNaOH:稱0、11432g，定容100ml。4。 1酚酞指示劑:稱取1g酚酞指示劑粉末、溶于100ml95乙醇溶液中、5。 95%醇：取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值100ml、6。 18%M生甲醛：取48ml38嘀甲醛力口入小于100ml容量瓶，往溶液中加兩滴酚酞用氫氧化鈉滴定剛好變紅,定容

11、到100ml。（四）器材玻璃試管、試管架、吸管(1ml,2ml,10ml)、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶(250ml,500ml)、量筒(250ml,500ml,1000ml)、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟(針)、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫箱、臺秤、5L一發(fā)酵罐，無菌室、培養(yǎng)皿(直徑9cm)、陶瓦蓋、鋼管、鋼管放置器、恒溫培養(yǎng)室、滅菌刻度吸管、玻璃容器、稱量管、毛細(xì)滴管、天平、直尺或游標(biāo)卡尺、超凈工作臺，無菌培養(yǎng)皿,酒精燈，牛津杯,鐐子,移液器等等(五)、生物效價(jià)測定所需材料菌種：大腸桿菌(Escherichiacoli),菌液濃度約為106個(gè)/mL。菌株保存得時(shí)間過久，影響其對抗生素得

12、敏感度，導(dǎo)致抑菌圈變大、模糊或者出現(xiàn)雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣得結(jié)果。因此，菌液在使用一段時(shí)間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中得稀釋倍數(shù)、(2)抗牛素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品:頭抱拉定標(biāo)準(zhǔn)品與供試品。(3)培養(yǎng)基：效價(jià)檢定用培養(yǎng)基1號。(4)無菌緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59g,磷酸二氫鉀0、41g,加水1000mL即為pH7.8得磷酸鹽緩沖液。制備緩沖液得試劑應(yīng)為分析純，配制后得緩沖液應(yīng)澄清，分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121c蒸氣滅菌30min備用。草酸，10MNaOH四、實(shí)驗(yàn)步驟篩選高產(chǎn)放線菌從土壤里篩選出高產(chǎn)放線菌,于斜面培養(yǎng)基中保藏接種在超凈工作臺上，將長好得斜面抱子用無菌接種針挖塊

13、約0。5X1 cm2,接種于滅過菌得高氏一號培養(yǎng)基中。培養(yǎng)將接種好得種子搖瓶于28C恒溫室搖床上，轉(zhuǎn)速為200r/min,培養(yǎng)48小時(shí)左右。實(shí)罐滅菌1 、將冷凝水管路斷開,拔下電極,打開罐蓋,將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐及補(bǔ)料瓶,易產(chǎn)生泡沫得培養(yǎng)基盡量不要超過兩升、2?、連接管路:取樣管路連接,補(bǔ)料管路連接;空氣過濾器用硅膠管與罐蓋空氣管連接,并用彈簧夾夾緊;排氣口與過濾器用硅膠管連接;安裝溫度電極、pH電極、溶氧電極，pH電極用們帽蓋緊電極上端口，溶氧電極用鋁鉑紙包裹電極上端口,防止受潮。蓋緊其它罐蓋接口。3?、提起玻璃罐體及補(bǔ)料瓶放入滅菌鍋,蓋好牛皮紙,蓋好鍋蓋,確定發(fā)酵溫度及時(shí)間、4、滅菌結(jié)束

14、后,盡快將罐放回原位并盡快通入空氣。發(fā)酵操作1、將滅菌后得罐體放回原位，連接冷凝水管路，通入冷凝水，連接通氣管路，調(diào)整通氣量至35L/min。？2、將溫度電極、pH電極、溶氧電極與控制器連接。？3、補(bǔ)料管連接：打開補(bǔ)料蠕動泵防護(hù)蓋,搬開進(jìn)出口處得白色管夾,將硅膠管嵌入入口處得管夾并夾緊，用手轉(zhuǎn)動泵頭，將硅膠管沿凹梢安裝直至出口處，開手動開關(guān)約十秒后夾緊出口處管夾，關(guān)手動開關(guān)；將酒精棉球放在罐蓋補(bǔ)料口內(nèi)，將針頭插入并穿透密封蓋；可開蠕動泵手動開關(guān)，使輸液管中充滿料液，置于自動狀態(tài)。接種將培養(yǎng)48小時(shí)得搖瓶種子接種于發(fā)酵罐中，使用接種圈放置酒精棉點(diǎn)燃，進(jìn)行無菌接種，接入100ml種子、接種后立即進(jìn)

15、行第一次取樣、發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵過程得測定：發(fā)酵液狀態(tài)觀察：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)發(fā)酵中殘?zhí)堑脺y定一DNS&:1。取1。0mg/m1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按下表加入試劑。沸水浴加熱5min,冷水冷卻定容至25ml搖勻，在520nm按波長測吸光度。編號葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/ml水/ml溶液糖含量/mgDNS試劑/ml1 ?01、80?1。50.2?1、50.41、51、51.51、01、412 51.6?1。520、41.630、6?1、40?640。8122?0。851.01。01、561.2?0.8?1、21?。571。40.681。60.42、取發(fā)酵液0。5m1置于50ml容量瓶中，力口6mol

16、/l得鹽酸溶液2ml,在沸水溶液中加熱15min水解，冷水冷卻后及時(shí)6mo氫氧化鈉溶液1、8ml,并定容到50ml得總糖水解液。3.取總糖水解液2ml于25m1比色管中，加入DNS試劑1。5ml沸水浴中加熱5min，冷水冷卻后定容至25ml搖勻，以空白作對照在520nm波長測吸光度。氨基酸氮得測定：甲醛法（陳鈞鳴與徐玲娣，1991）、取2ml發(fā)酵液濾液于三角瓶內(nèi)，加蒸儲水10ml,甲基紅指示劑2滴，用。3MHCI調(diào)節(jié)pH至溶液呈紅色，再用0、02858MNIaOH容液調(diào)pH至溶液呈橙色（中性），加18%中性甲醛溶液4ml,搖勻，靜置10min,加l%酚醐指示劑8滴，用0。02858NNaOHf

17、e準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。氨基氮得計(jì)算公式為：氨基氮（mg/l00ml）=滴定體積*2放線菌次級代謝物得初步純化及牛津杯實(shí)驗(yàn)得1、配制培養(yǎng)基身壓火困。2 、倒平板。3 、涂布指示菌。4、以無菌操作在培養(yǎng)基表面直接垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。5、收集發(fā)酵液，緩緩加入草酸將發(fā)酵液酸化至pH1、43.0左右,70C,2min,以10000rpm離心20min。6、取上清加入水稀釋20溢右，在4C,用10MNaOH中與至pH6.46、8、7、吸取中與液100wL加入牛津杯中，37C培養(yǎng)16hr,觀察結(jié)果、效價(jià)測定1 。稱量稱量前,將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品從冰箱取出,使與室溫平衡,

18、供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少30min方可稱取。供試品與標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用同一天平；吸濕性較強(qiáng)得抗生素在稱量前12小時(shí)更換天平內(nèi)干燥劑。標(biāo)準(zhǔn)品稱量不可少于20mg,取樣后立即將稱量瓶或適宜得容器及被稱物蓋好,以免吸水稱樣量得計(jì)算W可*C/P（式2、104）式中:W:需稱取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品得重量（mg）V:溶解標(biāo)準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時(shí)用容量瓶得體積量（mL）C：標(biāo)準(zhǔn)品或供試品高劑量得濃度（U/mL,wg/mL）P：標(biāo)準(zhǔn)品得純度或供試品得估計(jì)效價(jià)（U/mg小gmg）2 、稀釋從冰箱中取出得標(biāo)準(zhǔn)品溶液,必須先在室溫放置,使其溫度達(dá)到室溫后,方可量取。標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液得稀釋應(yīng)采用容量瓶,每步稀釋,取樣量不得少于2mL,稀釋步驟一般不超過3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次,吸取樣品溶液后,用濾紙將外壁多余液體擦去,從起始刻度開始放溶液、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品用得緩沖液應(yīng)同一批與同瓶,（預(yù)計(jì)不夠時(shí),應(yīng)事先與另一瓶混勻后再用）,以免因pH或濃度不同影響預(yù)定結(jié)果。稀釋時(shí),每次加液至容量瓶近刻度前,稍放置片刻,待瓶壁得液體完全流下,再準(zhǔn)確補(bǔ)加至刻度、標(biāo)準(zhǔn)品與供試品高低濃度之比為2:1或4:1,但所選用得濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。3. 雙碟制備在超凈工作臺上，用滅菌大口吸管（20mL）,取已融化得培養(yǎng)基20