離子交換層析分離純化蔗糖酶

1、專業(yè)： 姓名： 學(xué)號(hào)： 日期： 地點(diǎn)： 裝 訂 線實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲） 指導(dǎo)老師： 成績(jī)：_同組學(xué)生姓名： 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、?shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填） 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填） 六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填） 八、討論、心得 離子交換柱層析分離純化蔗糖酶1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?、學(xué)習(xí)離子交換層析的基本原理； 2、學(xué)習(xí)離子交換層析分離蛋白質(zhì)的基本方法和技術(shù)；3、學(xué)習(xí)蔗糖酶活性檢測(cè)的基本原理和方法。 2、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理：1、 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡(jiǎn)

2、稱為IEC）離子交換層析是常用的層析方法之一。它是以離子交換劑為固定相，根據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換劑與流動(dòng)相中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。這些過程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白質(zhì)所帶的電荷存在差異，因而與離子交換劑的親和力就有區(qū)別。當(dāng)洗脫液的pH改變或者鹽的離子強(qiáng)度逐漸提高時(shí)，使某一種蛋白質(zhì)的電荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，不同的蛋白質(zhì)按所帶電荷的強(qiáng)弱逐一被洗脫下來，達(dá)到分離的目的。離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基

3、團(tuán)（或功能基團(tuán)）和反離子構(gòu)成。溶液中的離子或離子化合物 基質(zhì)電荷基團(tuán)反離子 陽離子交換劑 基質(zhì) + =可逆交換= + 陰離子交換劑 基質(zhì) + =可逆交換= 由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 緩沖液環(huán)境中，粗分離純化樣品蔗糖酶帶負(fù)電荷，因此我們用陰離子交換劑可以先與蔗糖酶樣品可逆交換吸附，然后通過用鹽離子強(qiáng)度逐漸提高的洗脫液，使蔗糖酶和其他雜蛋白質(zhì)的電荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，把不同的蛋白質(zhì)按所帶電荷的強(qiáng)弱逐一被洗脫下來，從而達(dá)到分離蔗糖酶的目的。2、 酶活力檢測(cè)(定性檢測(cè)） 蔗糖酶（-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗

4、糖）的1,2糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖。還原糖的測(cè)定有多種方法，如采用3.5二硝基水楊酸法，其原理是3.5二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。本實(shí)驗(yàn)在離子交換層析分離純化的過程中，對(duì)分離純化樣品采用3.5二硝基水楊酸法來初步判定樣品中還原糖含量的多少，由此來確定并收集蔗糖酶純化樣品。3、 實(shí)驗(yàn)材料與試劑：1、實(shí)驗(yàn)材料 蔗糖酶粗分離純化樣品2、實(shí)驗(yàn)試劑 DEAE-Sepharose Fast Flow (弱堿性陰離子交換劑)； 20mmol/L Tris-H

5、Cl pH7.3 緩沖液； 20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl） pH7.3緩沖液(學(xué)生自配）； 0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5 ； 5%蔗糖溶液 ； 3，5-二硝基水楊酸試劑 甲液：溶解6.9g 結(jié)晶酚于15.2ml 10NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。 乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水楊酸溶液. 甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。4、 實(shí)驗(yàn)器材與儀器：1、高速冷凍離心機(jī)；2、層析柱（1.020 ）(1支

6、/組）；3、恒流泵（流速0.81ml/min）(10rpm)（1臺(tái)/組）；4、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/組）；5、核酸蛋白檢測(cè)儀（靈敏度0.5A）（1臺(tái)/組） ；6、記錄儀（紙速：0.5mm/min；靈敏度：50mV）（1臺(tái)/組） ；7、部分收集器及收集試管（4ml/管）（1臺(tái)/組） ；8、鐵架臺(tái)、夾子 （固定層析柱用）（1套/組） ；9、20冰箱（保存樣品用）；10、微量移液槍 200ul、1000ul；11、1.5ml離心管（留樣品和樣品用）；12、7ml離心管（留樣品用） ；13、恒溫水?。?00）；14、試管、移液管、試管架等。5、 操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟：1、離子交換劑準(zhǔn)備：

7、(實(shí)驗(yàn)室已準(zhǔn)備好） DEAESephadex， 取適量DEAESephadex，加入0.5mol/L NaOH溶液，輕輕攪拌，浸泡0.5小時(shí)，用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 攪勻，浸泡0.5小時(shí)，同上，用去離子水洗至近中性，（DEAE- Sepharose Fast Flow，用后務(wù)必回收）。浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液中平衡備用。2、樣品處理：將乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白樣品充分溶解于15ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液；4 15000r/min, 離心10分鐘，收

8、集樣品上清液（樣品）測(cè)量總體積(ml數(shù)），留取1ml（樣品）用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力的測(cè)定以及用于SDS-PAGE分析；將其余樣品（樣品）作離子交換柱層析進(jìn)一步分離純化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力檢測(cè)）。3、純化檢測(cè)儀器連接： 將梯度混合器(100ml梯度杯)，層析柱（1.020 ），恒流泵 (10rpm) （流速0.81ml/min），核酸蛋白檢測(cè)儀（靈敏度0.5A），記錄儀（紙速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（45 ml/管/5min）等按下圖連接并設(shè)置好。純化檢測(cè)儀器連接示意圖：1、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3緩沖液2、 50m

9、l 20mmol/L Tris-HCl，（ 1mol/L NaCl） pH7.3緩沖液4、裝柱(層析柱規(guī)格120cm)、平衡 ： 裝柱前先調(diào)好流速0.8ml1ml/min，然后將柱下端的出水口關(guān)閉，加進(jìn)5ml（約1/3柱床體積） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的緩沖液，然后將處理好的DEAESepharose Fast Flow，輕輕攪勻（注意不能太稀，也不能太稠，剛好呈流質(zhì)狀態(tài)）沿玻棒靠近柱管壁慢慢連續(xù)加進(jìn)柱內(nèi)至層析柱上端。注意不能帶進(jìn)氣泡，待凝膠自然沉積離柱管上端約1-2cm后松開層析柱出口，控制流速 0.8ml1ml/min；待柱內(nèi)DEAE Sepharose Fast

10、 Flow 凝膠沉降至穩(wěn)定高度并分出水層后，吸去水層，用玻棒將沉降界面攪勻，再補(bǔ)加處理好的DEAESepharose Fast Flow凝膠，直到凝膠沉降至穩(wěn)定高度距層析柱上端約3cm處為止（這時(shí)須保持DEAESepharose Fast Flow凝膠柱面平整）。用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的緩沖液連通層析柱，進(jìn)行柱平衡，直到流出液與緩沖液的pH一致。5、加樣：停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液。待緩沖液液面與膠體表面相切時(shí)，恒流泵停止工作。用膠頭滴管緩慢將蔗糖酶蛋白樣品溶液（樣品）加入層析柱中，注意順著柱壁滴加，盡可能保持膠面平整。打開恒流泵

11、，使樣品溶液進(jìn)入膠體，待樣品溶液完全進(jìn)入膠體后，用少量洗脫緩沖液將殘余在層析柱壁上端的樣品洗下，并完全進(jìn)入膠體后，再加洗脫緩沖液至一定高度。6、洗脫：方法1梯度洗脫法： 加樣后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液進(jìn)行平衡，洗脫流速為0.8ml1ml/min，洗去未被DEAE Sepharose Fast Flow凝膠吸附的雜蛋白，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測(cè)儀上繪出的基線穩(wěn)定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液NaCl梯度洗脫（濃度為0-1mol/L NaCl ），層析柱聯(lián)上梯度混合器，混合器中分別為50ml 0.05mol/L Tris-HCl p

12、H7.3緩沖液和50ml含1mol/L NaCl的0.05ml/L Tris-HCl pH7.3緩沖液。洗脫流速為0.81ml/min，每4ml接一管，洗脫至緩沖溶液流完為止。跟蹤測(cè)定各管的蔗糖酶活力，將蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，測(cè)量總體積（ml數(shù)）（樣品），并留樣用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力測(cè)定、SDS-PAGE分析、酶的基本性質(zhì)實(shí)驗(yàn)和用于“用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響”（半自主性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)） ，樣品20低溫保存?zhèn)溆?。方?、一步洗脫法： 上樣后， 用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液進(jìn)行平衡，洗脫流速為0.8ml1ml/min，洗去DEAESephar

13、ose Fast Flow未吸附的雜蛋白，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測(cè)儀上繪出的基線穩(wěn)定。用0.15mol/LNaCl 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液繼續(xù)洗脫被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脫流速為0.8ml1ml/min，4ml/管/5min，直至待層析柱流出液在核酸蛋白檢測(cè)儀上繪出的基線穩(wěn)定。測(cè)定各接收管的蔗糖酶活力，將蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出總體積（ml數(shù)）（樣品），并留樣用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力測(cè)定和SDS-PAGE分析以及用于“用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響”（半自主性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)），樣品20低溫保存?zhèn)溆谩?7、 蔗糖酶活力檢測(cè)空白對(duì)照樣品管0.

14、2mol/L乙酸緩沖液，pH=4.50.5ml0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml蒸餾水1.0ml0.9ml分離純化樣品溶液/0.1ml50水浴10分鐘3,5-二硝基水楊酸1.0ml1.0ml100水浴5分鐘蒸餾水5ml5ml觀察顏色 收集活力高的蔗糖酶液，測(cè)量總體積(ml數(shù)) （樣品），-20保存?zhèn)溆?，用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力測(cè)定和SDS-PAGE分析以及用于用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響（限定性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)）。6、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理： 7、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析： 8、 討論、心得：1. 本實(shí)驗(yàn)所用的弱堿性陰離子交換劑（DEAE-Sepharose Fast Flow）價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)過程中要注意，不要外撒，不要浪費(fèi)。2. 在連接純化檢測(cè)儀器時(shí)要注意先后順序，制作層析柱時(shí)柱下端的旋鈕一定要有膜覆蓋，否則在分離純化的過程中交換劑也會(huì)流下來。3. 在裝柱前要先把DEAESeph