膜片鉗的發(fā)展與應(yīng)用

1、膜片鉗技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用崔夢夢（生命科學(xué)學(xué)院 1241410026）摘要：膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，該技術(shù)的核心是能夠記錄單一離子通道的電流。膜片鉗可以測量到0.06pA的電流，它具有1um的空間分辨率和10us的時間分辨率。作為先進的細胞電生理技術(shù)，膜片鉗一直被奉為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以證實細胞膜上離子通道的存在并能對其電生理特性、分子結(jié)構(gòu)、藥物作用機稍等進行深入的研究。此外，將膜片鉗技術(shù)與其他一些先進的技術(shù)結(jié)合，使其在藥理學(xué)、病理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、腦科學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等生物科學(xué)方面,，得到了越來越廣泛的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：膜片鉗；離子通道；發(fā)展與應(yīng)用在

2、細胞膜上存在有許多的離子通道，這些離子通道是細胞興奮性的基礎(chǔ)，對細胞內(nèi)以及細胞之間的信息傳遞起著非常重要的作用。為探究離子通道的功能和結(jié)構(gòu)，許多電生理技術(shù)被發(fā)明創(chuàng)造。英國學(xué)者Huxley和Katz最早應(yīng)用電壓鉗來研究細胞膜上離子通道的電流變化，但由于該技術(shù)鉗制的細胞膜面積很大，包含著大量隨機開放和關(guān)閉著的離子通道，因而不能測定單一離子通道電流。所以在1976年德國神經(jīng)生物學(xué)家Erwin Neher和Bert Sakmann建立起一種新的技術(shù)，即膜片鉗技術(shù)，并且逐漸取代了電壓鉗技術(shù)。隨著膜片鉗技術(shù)的不斷完善，自1981年以來, 該技術(shù)已經(jīng)在不同動物的肝、脾、胃腸、心肌、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌等

3、各類細胞上應(yīng)用并取得了研究成果。膜片鉗技術(shù)點燃了細胞和分子水平的生理學(xué)研究的革命之火，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進動力。一、膜片鉗技術(shù)的基本原理膜片鉗技術(shù)是利用玻璃微電極尖端經(jīng)拋光后貼附于神經(jīng)元膜上，與玻璃微電極尖端相接的膜僅含13個離子通道，然后通過負壓吸引將這片膜與周圍的膜實行高阻封接，因此在電極尖端覆蓋下的那片膜，在電學(xué)上已于膜的其他部分相互分隔。電極尖端下的膜通道開放所產(chǎn)生的電流流進玻璃微電極吸管，通過一極其敏感的膜片鉗放大器，就可測量得到單一離子通道電流。電極尖端的直徑一般可達0.5um，它與膜的高阻封接可達到10億歐，因而極大提高了膜片鉗技術(shù)的可靠性和靈敏度。二、膜片鉗技術(shù)的改進

4、與新進展（一）穿孔膜片鉗技術(shù)1988年Horn等對傳統(tǒng)全細胞記錄進行了改進，建立了穿孔膜片鉗技術(shù)。即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性質(zhì)，將這類抗生素充灌在電極液中，在高阻封接形成之后自發(fā)形成全細胞記錄模式。該技術(shù)中，抗生素形成孔道的有效半徑為0.40.8 nm，可以選擇性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一價離子，使細胞內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定，電流的衰減現(xiàn)象減弱。并且抗生素對細胞的損傷作用小，高阻封接不易被破壞，記錄的持續(xù)時間延長。這種技術(shù)需要在避光條件下配制含有抗生素的穿孔液，配好后于4避光保存。充灌電極時， 先用不含抗生素的電極液充灌，然后再加入含有抗生素的電極液

5、反向充灌電極。在這個過程中，應(yīng)快速形成高阻封接，避免抗生素擴散到電極尖端抑制高阻封接的形成。（二）在體膜片鉗技術(shù)在體全細胞記錄膜片鉗開始于研究感覺系統(tǒng)對外界刺激的反應(yīng)特性和機理，因為這在離體標(biāo)本上幾乎是無法實現(xiàn)的。早期研究感覺系統(tǒng)的活體動物實驗大多使用細胞外記錄方法，這可以研究細胞對自然刺激如光，聲音等的反應(yīng)特性和規(guī)律，但不能涉及感覺信息處理的機制。這是因為細胞外單細胞記錄只能得到一個細胞的最終輸出，即動作電位，而不能獲得其突觸電位的波形，也忽略了所有的閾下反應(yīng)。早期膜片鉗記錄的標(biāo)本大多為急性分離的細胞，到20世紀(jì)80年代末，腦片全細胞膜片鉗技術(shù)出現(xiàn)，20世紀(jì)90年代一些實驗室在借鑒腦片膜片鉗

6、技術(shù)的基礎(chǔ)上，嘗試在整體動物( 一般是麻醉狀態(tài)) 上進行膜片鉗記錄。最早的報道是Pei等在德國馬普研究所的工作。他們通過對成年貓視皮層神經(jīng)元進行全細胞記錄，然后觀察來自不同方向的光刺激所對應(yīng)的突觸后電流反應(yīng)，以此探討視覺信號傳遞和形成機制， 以及視皮層神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的關(guān)系。但可能是由于電極與細胞膜的封接不夠好，記錄到的細胞靜息膜電位絕對值較小，動作電位的幅度也比正常值低很多。隨后許多國家都開始了對在體膜片鉗技術(shù)的研究。目前該技術(shù)越來越成熟，記錄到的反應(yīng)也越來越符合實際。（三）全自動膜片鉗技術(shù)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)每次只能記錄一個細胞（或一對細胞），對實驗人員來說是一項耗時耗力的工作，它不適在藥物開發(fā)

7、初期和中期進行大量化合物的篩選，也不適合需要記錄大量細胞的基礎(chǔ)實驗研究，全自動膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)在很大程度上解決了這些問題。全自動膜片鉗技術(shù)是離子通道檢測的新技術(shù)，它具有直接性、高信息量及高精確性的特點。與傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)相比，它主要具有以下優(yōu)點：效率高，是傳統(tǒng)膜片鉗效率的20300倍；不需要專業(yè)電生理人員，簡單易用，所有的操作可以在電腦軟件控制的界面下完成，無須顯微防震系統(tǒng)；大部分儀器的封接質(zhì)量在1G歐以上；部分儀器同時適用于研究配體門控通道和電壓門控通道；主要應(yīng)用于藥物藥理和毒理測試；在藥物微量加樣設(shè)計方面表現(xiàn)優(yōu)秀；儀器主要工作方式為全細胞膜片鉗方式。隨著基因組測序的完成和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，

8、離子通道在未來的細胞與藥物方面研究將會變得越來越重要。與此同時，作為離子通道研究的最佳伴侶全自動膜片鉗技術(shù)將會越來越重要，而且其應(yīng)用領(lǐng)域也將越來越大。三、膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用（一）在心臟電生理方面的應(yīng)用人類心臟主要存在Na+通道、K+通道等主要的離子通道。心臟的自發(fā)節(jié)律性是受心肌細胞的電活動控制的，而心肌電活動的基礎(chǔ)便是心肌細胞的各種離子電流的變化。因此膜片鉗技術(shù)可以用來分析心肌靜息電位及其自發(fā)去極化的機制，對鈉、鉀、鈣和乙酰膽堿通道的調(diào)控機制進行更深入的了解。此外，膜片鉗技術(shù)也可以用來分析心臟在病理狀態(tài)下引起通道活性和受體功能改變，從而可以從根本上對各種心臟病進行診斷和治療。（二）在血管研究中的

9、應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞的凋亡與K+通道活動增加有關(guān)，在動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展過程中，電導(dǎo)型鈣激活鉀通道起著重要的功能作用。某些藥物影響動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞離子通道而發(fā)揮作用。膜片鉗技術(shù)給動脈粥樣硬化發(fā)病機理研究帶來了新的亮點。Wiecha等應(yīng)用膜片鉗技術(shù)對冠狀A(yù)s斑塊平滑肌細胞與正常冠狀動脈平滑肌細胞的特性進行了比較研究。結(jié)果表明冠狀A(yù)s斑塊平滑肌細胞BKCa比正常冠狀動脈平滑肌細胞BKCa有較高的通道活性。這一發(fā)現(xiàn)意味著BKCa通道在動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的功能作用。(三)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以研究神經(jīng)信號的產(chǎn)生和傳導(dǎo)。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脆弱性和難以接近性

10、，研究腦的網(wǎng)絡(luò)特性及其復(fù)雜的調(diào)控功能是十分困難的。在具有簡單網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的離體腦片上應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，為這一方面的深入研究開辟了一個嶄新的領(lǐng)域。目前將膜片鉗技術(shù)應(yīng)用到神經(jīng)系統(tǒng)的研究是不少的。但主要側(cè)重于用膜片鉗技術(shù)觀察不同部位細胞形態(tài)學(xué)和電生理特性的研究；各種化學(xué)藥物的作用對神經(jīng)系統(tǒng)影響的研究；適于膜片鉗技術(shù)研究的細胞的制備及分離方法。（四）在藥理學(xué)中的應(yīng)用藥物研制的關(guān)鍵在于探測藥物作用的靶點。在藥物篩選中，將目的藥劑以吹打或灌注方式直接施加于培養(yǎng)細胞。借助特定離子通道阻斷劑，利用膜片鉗方可迅速判明藥物作用及作用方式等問題。因此，膜片鉗對于藥品的研制、生產(chǎn)都有著十分巨大的促進作用。制藥企業(yè)還可以利用

11、當(dāng)前新興藥物虛擬篩選技術(shù)進行初篩，把初篩結(jié)果再結(jié)合全自動膜片鉗技術(shù)進行實驗上的驗證。虛擬篩選的目的是從數(shù)十萬到數(shù)百萬化合物庫中篩選出可能的小分子化合物，再進一步進行實驗研究。把全自動膜片鉗技術(shù)結(jié)合以離子通道為靶標(biāo)的高通量虛擬篩選研究技術(shù)，無疑將會極大的縮短研究時間和節(jié)省大量的研究經(jīng)費。除此之外，膜片鉗技術(shù)還可以應(yīng)用于胃腸道研究、信息傳遞、中藥理論等多個理論中?？傊てQ技術(shù)以其實用、快速、靈敏、準(zhǔn)確及重復(fù)性好等技術(shù)優(yōu)勢已經(jīng)在大量的研究中得到證實。膜片鉗技術(shù)為從分子水平了解生物膜離子通道的門控動力學(xué)特征及通透性、選擇性等膜信息，提供了最直接的手段，使人們對細胞膜通道功能的認識進入了一個嶄新的階段

12、。四、膜片鉗技術(shù)與其他技術(shù)的結(jié)合隨著科學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究需要多種技術(shù)的配合運作。雖然膜片鉗技術(shù)有很強的記錄分析功能，單純應(yīng)用仍遠不足以研究、解釋生命活動的許多現(xiàn)象。因此，出現(xiàn)了與其它技術(shù)的結(jié)合運用。（一）膜片鉗技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合分子生物學(xué)是從分子水平上研究生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其功能的科學(xué)，膜片鉗技術(shù)利用微電極來研究細胞膜上離子通道的通透性和電位的變化，二者之間的結(jié)合，可以將神經(jīng)細胞離子通道的結(jié)構(gòu)特性和物理特性展現(xiàn)出來。同時，可在同一細胞中分離提取特異性表達的mRNA。用膜片鉗進行全細胞記錄的同時，收集細胞胞漿，然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳

13、和DNA序列進行分析。再用特異性引物來區(qū)別離子通道亞單位，揭示神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，從基因水平研究神經(jīng)傳導(dǎo)通路，提高對神經(jīng)系統(tǒng)本質(zhì)的認識。（二）膜片鉗技術(shù)與熒光技術(shù)的結(jié)合一些熒光探針常用于檢測細胞內(nèi)的鈣離子濃度，它們能與鈣離子結(jié)合，產(chǎn)生較強的熒光，通過膜片微電極將其引入細胞，可以利用膜片鉗記錄細胞內(nèi)的鈣離子濃度，鈣離子的釋放及內(nèi)流等情況，研究細胞膜鈣離子通道的開放、關(guān)閉的動力學(xué)特征及生理學(xué)效應(yīng)。（三）膜片鉗技術(shù)與碳纖電極局部電化學(xué)微量檢測技術(shù)的結(jié)合如果給碳纖電極一個適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定的電壓，使接近或吸附到碳纖電極表面的某些物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)而釋放出電子，碳纖電極可俘獲這些電子，而電子流過電極產(chǎn)生電流

14、，因此根據(jù)所控測部位或培養(yǎng)細胞中某物質(zhì)氧化時所產(chǎn)生電流的不同，可判別分泌物(被探測物)的種類，并根據(jù)電流總量的大小，計算出該物質(zhì)的分泌量。1992年，Neher實驗室首次將膜片鉗膜電容檢測與碳纖電極聯(lián)合運用；1994年又將光電聯(lián)合檢測與碳纖電極局部電化學(xué)微量檢測技術(shù)結(jié)合，既能研究分泌機制，又能鑒別分泌物質(zhì)?？傊?，隨著膜片鉗技術(shù)的進一步完善以及與其他先進技術(shù)的結(jié)合，使其應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛，相信隨著研究的深入，其在生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用將會大放異彩。五、對膜片鉗技術(shù)的展望膜片鉗技術(shù)自建立以來，不斷的發(fā)展完善，對生命科學(xué)的研究做出了巨大的促進作用。對該技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)涉及到神經(jīng)科學(xué)、心血管科學(xué)、藥理學(xué)等

15、多個領(lǐng)域。在體膜片鉗技術(shù)與全自動膜片鉗技術(shù)的發(fā)展使神經(jīng)科學(xué)以及多細胞的研究等領(lǐng)域展開了新的局面。同時隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與進步，使得膜片鉗技術(shù)與其他先進的研究技術(shù)相結(jié)合，從而將膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用帶入到另一個高峰，在生命科學(xué)的研究領(lǐng)域中得到更廣泛的應(yīng)用。隨著膜片鉗技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的大放異彩，個個研究機構(gòu)都開始對膜片鉗技術(shù)進行或多或少的研究，并且將其應(yīng)用到各個不同的領(lǐng)域，使膜片鉗技術(shù)得到了更充分的發(fā)展與應(yīng)用。相信在不久的將來，膜片鉗技術(shù)必將為生命科學(xué)的發(fā)展做出更重要的貢獻。參考文獻【1】 曹建斌. 膜片鉗技術(shù)的發(fā)展及其應(yīng)用. 運城學(xué)院學(xué)報. 2009年4月,第27卷第2期：5355【2】 曹小于、鄭婉云、魯燕濱、黃超. 離子通道研究技術(shù)的最新進展全自動膜片鉗技術(shù) 儀器評介. 2007年第二期：4749【3】 田晶. 膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用進展. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報. 2008年08月,第29卷第4期：227229【4】 杜育哲、賀秉軍、劉麗、劉安西. 膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報. 2001年6月,第8卷第2期：2426【5】 喻卓. 膜片鉗技術(shù)及其在心血管研究中的應(yīng)用. 中國心臟起搏與心電生理雜志. 2000年,第14卷第2期：127129【6】 林燕飛、歐陽守. 膜片鉗技術(shù)研究進展及其應(yīng)用. 海峽藥學(xué). 2008年,第20卷第9