抗霉菌性陰道病三種中藥復方體外對白色念珠菌生物膜形成的影響

1、抗霉菌性陰道病三種中藥復方體外對白色念珠菌生物膜形成的影響         10-08-23 14:28:00     編輯：studa20                   作者：官妍 汪長中 沈非 吳泓 王艷 云云【摘要】  目的觀察3種中藥復方體外對白色念珠菌生物膜形成的影響。方法

2、采用結晶紫染色法和MTT 法評價白色念珠菌生物膜的體外生長動力學, 微量稀釋法檢測3種中藥復方對白色念珠菌懸浮菌及其生物膜的抑制作用以及藥物包被對白色念珠菌生物膜形成作用。結果生物膜內(nèi)白色念珠菌數(shù)量隨培養(yǎng)時間延長而增加。3種中藥復方對白色念珠菌懸浮菌的最低抑菌濃度50%(MIC50)分別為3.255,3.565,3.875 mg/ml,對生物膜的SMIC50與SMIC80分別是3.255，6.51，3.565，7.12 mg/ml，3.875，7.623 mg/ml。3種中藥復方包被濃度分別在7.882，3.808，6.357 mg/ml以上時對其生物膜形成的抑制作用有顯著性。結論3種中藥復方

3、對體外白色念珠菌生物膜具有明顯的抑制作用。 【關鍵詞】  中藥復方; 白色念珠菌; 生物膜    近年來，隨著廣譜抗生素、糖皮質激素、免疫抑制劑等的被廣泛使用，白色念珠菌等真菌引起的感染機會顯著增多。白色念珠菌等真菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，針對生物膜相關感染難治性、易復發(fā)，現(xiàn)有抗真菌藥物較少并具較強毒副作用等問題，必須尋找出更好的藥物和方法抗真菌及相關生物膜感染。目前中草藥治療真菌感染有不少報道,曾有文獻稱對862種中草藥(動物藥15種,礦物藥13種,植物藥834種) 進行了抗白色念珠菌的活性篩選,其中有初步活性的103種(11.7%)1。但有關中草藥對念珠菌

4、生物膜的影響報道較少。本研究從文獻、臨床收集了對霉菌性陰道炎有較明顯作用的中草藥復方3種,進行體外抗白色念珠菌生物膜作用的實驗2,探討這些中藥復方對體外念珠菌生物膜形成的影響, 旨在為解決念珠菌感染性疾病易復發(fā)、易產(chǎn)生耐藥性提供新的途徑。1  材料與儀器1.1  菌株白色念珠菌標準菌株ATCC10231，購于合肥市疾病控制中心。1.2  藥物3種中藥復方。    復方1(坐浴劑，安徽中醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院婦科組方):苦參10 g,百部30 g,野菊花30 g,蛇床子50 g,土槿皮30 g,公丁香10 g,黃柏50 g。 &#

5、160;  復方2(滅霉靈擦洗劑)3:茜草30 g,黃連20 g,黃柏20 g,苦參20 g,虎杖30  g,蛇床子10 g,艾葉10 g,白鮮皮10 g,土槿皮10 g,丁香9 g,百部30 g,蒼術15 g,藿香15  g,黃精20 g,枯礬9 g。    復方3(坐浴劑)4:萆薢12 g,薏苡仁15 g,土茯苓30 g,藿香15 g,白礬30 g,薄荷5 g。    以上3種中藥復方均購于安徽中醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中藥房,并經(jīng)鑒定。每方均經(jīng)水浸泡30 min后,常規(guī)水煎,藥物濃度均調(diào)至每毫升含1 g生

6、藥。1.3  培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司),YPD培養(yǎng)基依據(jù)文獻5配制。1.4  試劑結晶紫( 天津市光復精細化工研究所),四甲基偶氮唑鹽(MTT,Sigma 公司),二甲基亞砜(DMSO,上海金山化工廠) 。1.5  檢測儀器318-酶標儀(上海),96 孔微量培養(yǎng)板(杭州生友生物技術有限公司)。2  方法2.1  白色念珠菌生長動力學的檢測5，6將濃度1×106個細胞/ml的菌液100 l接種于96孔微量培養(yǎng)板中,37培養(yǎng),分別于接種后2，4，6，8，24，48 h,棄去培養(yǎng)基, 用PBS(pH 7.2)洗去未黏

7、附菌。用結晶紫染色法7測定白色念珠菌生物量(biomass):將1%結晶紫100 l加入孔內(nèi),37孵育20 min,PBS洗3遍,酶標儀490 nm 波長下檢測吸光度。2.2  3種中藥復方對懸浮白色念珠菌MIC的測定 依據(jù)NCCLS 的M27-A方案8,先按二倍稀釋將藥物100 l加到96孔板中,再加入0.5×1032.5×103/ml菌體的混懸液100 l,37培養(yǎng)48 h,以無菌生長的最小藥物稀釋度作為各菌株的最低抑菌濃度(MIC) 。2.3  3種中藥復方對白色念珠菌生物膜MIC( SMIC)的測定9將白色念珠菌接種于YPD 培養(yǎng)基中,37搖床過

8、夜培養(yǎng),收集菌體,用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋,調(diào)整菌液濃度為1×106/ml。將100 l該96 孔板中,37培養(yǎng)24 h,使白色念珠菌完全黏附于平底的96孔板基底表面,形成念珠菌生物膜的結構。生物膜形成后,棄去培養(yǎng)基及懸浮菌,用PBS洗3次,將藥物按兩倍稀釋加到各孔中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。MTT法檢測抑制生物膜50%( SMIC50) 及80%( SMIC80) 的藥物濃度:即50 l的MTT 溶液( 貯存液含5 mg/ml PBS,臨用前用預溫的0.15 M PBS 按15 稀釋)加入每孔中, 37孵育5 h。棄去含MTT的培養(yǎng)基,PBS洗3遍,加入DMSO100 l,振蕩5 min,在酶標儀490 nm波長下檢測吸光度。2.4  3種中藥復方預處理96孔板10用無菌的PBS將五種中藥復方分別按二倍連續(xù)稀釋成7個濃度梯度: 100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56 mg/ml, 200 l/孔,4過夜。吸棄藥物,PBS洗1遍,每