抗霉菌性陰道病三種中藥復(fù)方體外對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響

1、抗霉菌性陰道病三種中藥復(fù)方體外對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響         10-08-23 14:28:00     編輯：studa20                   作者：官妍 汪長(zhǎng)中 沈非 吳泓 王艷 云云【摘要】  目的觀察3種中藥復(fù)方體外對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響。方法

2、采用結(jié)晶紫染色法和MTT 法評(píng)價(jià)白色念珠菌生物膜的體外生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué), 微量稀釋法檢測(cè)3種中藥復(fù)方對(duì)白色念珠菌懸浮菌及其生物膜的抑制作用以及藥物包被對(duì)白色念珠菌生物膜形成作用。結(jié)果生物膜內(nèi)白色念珠菌數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。3種中藥復(fù)方對(duì)白色念珠菌懸浮菌的最低抑菌濃度50%(MIC50)分別為3.255,3.565,3.875 mg/ml,對(duì)生物膜的SMIC50與SMIC80分別是3.255，6.51，3.565，7.12 mg/ml，3.875，7.623 mg/ml。3種中藥復(fù)方包被濃度分別在7.882，3.808，6.357 mg/ml以上時(shí)對(duì)其生物膜形成的抑制作用有顯著性。結(jié)論3種中藥復(fù)方

3、對(duì)體外白色念珠菌生物膜具有明顯的抑制作用。 【關(guān)鍵詞】  中藥復(fù)方; 白色念珠菌; 生物膜    近年來(lái)，隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的被廣泛使用，白色念珠菌等真菌引起的感染機(jī)會(huì)顯著增多。白色念珠菌等真菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，針對(duì)生物膜相關(guān)感染難治性、易復(fù)發(fā)，現(xiàn)有抗真菌藥物較少并具較強(qiáng)毒副作用等問(wèn)題，必須尋找出更好的藥物和方法抗真菌及相關(guān)生物膜感染。目前中草藥治療真菌感染有不少報(bào)道,曾有文獻(xiàn)稱對(duì)862種中草藥(動(dòng)物藥15種,礦物藥13種,植物藥834種) 進(jìn)行了抗白色念珠菌的活性篩選,其中有初步活性的103種(11.7%)1。但有關(guān)中草藥對(duì)念珠菌

4、生物膜的影響報(bào)道較少。本研究從文獻(xiàn)、臨床收集了對(duì)霉菌性陰道炎有較明顯作用的中草藥復(fù)方3種,進(jìn)行體外抗白色念珠菌生物膜作用的實(shí)驗(yàn)2,探討這些中藥復(fù)方對(duì)體外念珠菌生物膜形成的影響, 旨在為解決念珠菌感染性疾病易復(fù)發(fā)、易產(chǎn)生耐藥性提供新的途徑。1  材料與儀器1.1  菌株白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231，購(gòu)于合肥市疾病控制中心。1.2  藥物3種中藥復(fù)方。    復(fù)方1(坐浴劑，安徽中醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦科組方):苦參10 g,百部30 g,野菊花30 g,蛇床子50 g,土槿皮30 g,公丁香10 g,黃柏50 g。 &#

5、160;  復(fù)方2(滅霉靈擦洗劑)3:茜草30 g,黃連20 g,黃柏20 g,苦參20 g,虎杖30  g,蛇床子10 g,艾葉10 g,白鮮皮10 g,土槿皮10 g,丁香9 g,百部30 g,蒼術(shù)15 g,藿香15  g,黃精20 g,枯礬9 g。    復(fù)方3(坐浴劑)4:萆薢12 g,薏苡仁15 g,土茯苓30 g,藿香15 g,白礬30 g,薄荷5 g。    以上3種中藥復(fù)方均購(gòu)于安徽中醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中藥房,并經(jīng)鑒定。每方均經(jīng)水浸泡30 min后,常規(guī)水煎,藥物濃度均調(diào)至每毫升含1 g生

6、藥。1.3  培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司),YPD培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)5配制。1.4  試劑結(jié)晶紫( 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),四甲基偶氮唑鹽(MTT,Sigma 公司),二甲基亞砜(DMSO,上海金山化工廠) 。1.5  檢測(cè)儀器318-酶標(biāo)儀(上海),96 孔微量培養(yǎng)板(杭州生友生物技術(shù)有限公司)。2  方法2.1  白色念珠菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)5，6將濃度1×106個(gè)細(xì)胞/ml的菌液100 l接種于96孔微量培養(yǎng)板中,37培養(yǎng),分別于接種后2，4，6，8，24，48 h,棄去培養(yǎng)基, 用PBS(pH 7.2)洗去未黏

7、附菌。用結(jié)晶紫染色法7測(cè)定白色念珠菌生物量(biomass):將1%結(jié)晶紫100 l加入孔內(nèi),37孵育20 min,PBS洗3遍,酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。2.2  3種中藥復(fù)方對(duì)懸浮白色念珠菌MIC的測(cè)定 依據(jù)NCCLS 的M27-A方案8,先按二倍稀釋將藥物100 l加到96孔板中,再加入0.5×1032.5×103/ml菌體的混懸液100 l,37培養(yǎng)48 h,以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度作為各菌株的最低抑菌濃度(MIC) 。2.3  3種中藥復(fù)方對(duì)白色念珠菌生物膜MIC( SMIC)的測(cè)定9將白色念珠菌接種于YPD 培養(yǎng)基中,37搖床過(guò)

8、夜培養(yǎng),收集菌體,用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋,調(diào)整菌液濃度為1×106/ml。將100 l該96 孔板中,37培養(yǎng)24 h,使白色念珠菌完全黏附于平底的96孔板基底表面,形成念珠菌生物膜的結(jié)構(gòu)。生物膜形成后,棄去培養(yǎng)基及懸浮菌,用PBS洗3次,將藥物按兩倍稀釋加到各孔中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。MTT法檢測(cè)抑制生物膜50%( SMIC50) 及80%( SMIC80) 的藥物濃度:即50 l的MTT 溶液( 貯存液含5 mg/ml PBS,臨用前用預(yù)溫的0.15 M PBS 按15 稀釋)加入每孔中, 37孵育5 h。棄去含MTT的培養(yǎng)基,PBS洗3遍,加入DMSO100 l,振蕩5 min,在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。2.4  3種中藥復(fù)方預(yù)處理96孔板10用無(wú)菌的PBS將五種中藥復(fù)方分別按二倍連續(xù)稀釋成7個(gè)濃度梯度: 100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56 mg/ml, 200 l/孔,4過(guò)夜。吸棄藥物,PBS洗1遍,每