蒲公英多糖體外抑瘤和抗突變作用研究

1、蒲公英多糖體外抑瘤和抗突變作用研究    【摘要】  目的觀察蒲公英多糖對肝癌細胞的抑制和抗突變作用。方法采用MTT法測定蒲公英多糖對肝癌細胞的抑制作用，用微核實驗檢測抗突變作用。結果蒲公英多糖隨濃度的增加對肝癌細胞的抑制率增加，但不明顯；可以顯著提高外周血細胞免疫力，拮抗由環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變（P0.01）。結論蒲公英多糖對肝癌細胞的抑制作用不明顯；能有效地拮抗環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變。 【關鍵詞】  蒲公英多糖 抑瘤 微核突變蒲公英Taraxacum L.是中醫(yī)臨床常用的中草藥,具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋、健胃消炎、保肝利膽

2、等功效1。河南學術科研網研究發(fā)現，蒲公英有抗菌2、抗突變3、抑瘤4、抗氧化5等多種藥理作用，并能提高機體免疫性，對抗環(huán)磷酰胺引發(fā)的DNA損傷6。蒲公英根部富含多糖7，研究發(fā)現多糖具有廣泛的藥理作用，其中多糖誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖是目前研究的熱點；同時外界環(huán)境誘發(fā)的突變是腫瘤細胞形成的重要因素之一。本文就蒲公英多糖對肝癌細胞的抑制以及對環(huán)磷酰胺誘發(fā)的突變的拮抗作用進行了研究。1  材料與儀器1.1  試劑PMI1640，美國GIBCO產品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所產品；環(huán)磷酰胺（CP），上海華聯(lián)制藥公司產品；噻唑蘭（MTT），Sigma公司產品；植物

3、血凝素（PHA），金爾康動物藥業(yè)有限公司；DMSO，北京索萊寶科技有限公司產品；Giemsa， Sigma公司產品。1.2  材料東北蒲公英T.ohwianum Kitag.采自黑龍江省五大連池自然風景區(qū)。蒲公英多糖的制備參照文獻8法進行。肝癌細胞Bel-7402和正常人外周血淋巴細胞均由齊齊哈爾醫(yī)學院饋贈。1.3  儀器KHB全自動酶標儀（ST-360），北京桑翌實驗儀器研究所產品；細胞培養(yǎng)箱，河北省虹宇儀器設備有限公司產品；96孔板，Greiner公司產品；超凈工作臺，ESCO公司產品。2  方法2.1  MTT法9檢測蒲公英多糖對肝癌細胞Bel-7

4、402的抑制作用運用改良的MTT實驗9計算蒲公英多糖對腫瘤的抑制作用，蒲公英多糖的終濃度為25，50，100，200，400，800，1 600，3 200 g/ml。陽性對照加CP，終濃度為260 g/ml；每個濃度均設6個平行孔。酶標儀的吸收波長采用570nm。    抑制率（IR）=（空白對照組OD值-多糖組OD值）/空白對照組OD值。采用SPSS數據包進行方差分析。2.2  微核實驗檢測蒲公英多糖拮抗環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變常規(guī)采人外周血與培養(yǎng)10。細胞培養(yǎng)24 h后，將蒲公英多糖用PBS溶液配成溶液，微孔濾膜過濾（0.2 m）。將多糖溶液加到培養(yǎng)

5、瓶內，使多糖濃度分別為50，200，800，3 200 g/ml。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，向每瓶內加入25 ml CP，使CP濃度達到100 g/ml。另設空白對照組和CP陽性對照組，空白對照組加PBS不加CP，CP陽性對照組加CP不加多糖。制片采用文獻10法進行。    統(tǒng)計：觀察計數1 000個可計數轉化細胞的微核（MN）數，計算千分率（MN）。用SPSS軟件包分析各組數據。抑制率（%）=（陽性組MN數-實驗組MN數）×100/陽性組MN數。河南學術科研網3  結果3.1  蒲公英多糖體外抑瘤作用蒲公英多糖對肝癌細胞Bel-7402的

6、細胞毒作用見表1。結果顯示，隨著蒲公英多糖濃度的增大，對腫瘤細胞的抑制作用也在增大，即蒲公英多糖對腫瘤細胞的抑制作用存在量依賴關系。但是即使在很大的濃度下（3 200 g/ml），多糖對腫瘤細胞的抑制率僅為27.94%，而此時蒲公英多糖溶液中已出現很少量的不溶解的多糖，因此，多糖的實際濃度未能達到實驗設計的水平。而CP在較低濃度（260 g/ml）下對腫瘤細胞的抑制作用就已經很顯著了(IR>30%)。一般認為，只有當抑制率達到30%以上才說明腫瘤細胞對藥物敏感11，蒲公英多糖對腫瘤細胞的最大抑制率小于30%，故認為蒲公英多糖對肝癌細胞Bel-7402沒有明顯的抑制作用。表1 

7、蒲公英多糖對Bel-7407的抑制作用（略）3.2  蒲公英多糖拮抗CP誘發(fā)的微核突變CP是一種烷化劑，是臨床常用的免疫抑制劑，能夠抑制細胞的增殖，常做抗癌藥物；同時它對正常細胞DNA的合成及分裂具有強烈的抑制作用，從而明顯誘發(fā)微核產生。由表2可知，陽性對照組（CP組）與空白對照組的微核率相差極為顯著（P<0.01）。蒲公英多糖對CP誘發(fā)的微核突變有明顯的抑制作用，細胞微核率與CP對照組相比差異極顯著（P<0.01），并且實驗各組的抑制作用呈劑量效應。由此可見，蒲公英多糖對CP誘發(fā)的外周血淋巴細胞微核突變有很顯著的拮抗作用，說明蒲公英多糖對遺傳物質具有保護作用，即抗突變作

8、用。表2  蒲公英多糖對CP誘發(fā)微核的拮抗作用（略）4  討論    本實驗表明，蒲公英多糖對腫瘤細胞的抑制作用存在著劑量效應，但是抑制作用不明顯。抑制作用不明顯可能是由于以下幾種原因：應用體外細胞培養(yǎng)進行抗腫瘤藥物的篩選有周期短、結果顯而易見的優(yōu)點，但是也存在著一定的局限性，主要表現在：假陰性結果導致有效藥物的漏篩。有些藥物如生物反應調節(jié)劑需要通過機體的反應才能對細胞起作用，有些藥物必須經過體內酶的代謝活化才能變成活性成分，此類藥物在進行體外篩選時就會產生假陰性結果，從而導致有效藥物的漏選，因此，體外試驗的結果必須通過體內試驗進一步驗證。本實

9、驗所用蒲公英多糖為熱水浸提法獲得，提取過程中采用80，這個溫度會不會破壞多糖的生物活性尚未可知；并且所用的多糖為精制粗多糖，沒有經過純化，其中的微量蛋白質等成分可能對細胞的增殖有影響；或者不同分子量的多糖對腫瘤的作用也不相同，它們的相互作用使得蒲公英多糖的抑瘤效果不顯著。蒲公英多糖的抑瘤作用有可能是通過提高機體免疫功能而發(fā)揮作用。蒲公英多糖可以有效拮抗由環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核突變，保護DNA不受損傷。雖然蒲公英多糖對腫瘤細胞沒有直接抑制作用，但是也說明了蒲公英多糖對細胞沒有毒害作用，不會對正常細胞產生細胞毒性作用，在臨床上不會由于使用蒲公英多糖而帶來對機體的副作用?？梢栽O想，在臨床上將蒲公英多糖與

10、抑瘤藥物配合使用，既增強了藥物的抑瘤作用，又可以有效保護正常細胞不受損傷，這將在進一步的實驗研究中進行探索?！緟⒖嘉墨I】  1許丹，侯鳳飛，吳立軍，等.蒲公英的化學研究J中國中藥雜志，2004，29（3）：2782黃玲，王建華，勞紹賢，等黨參、川芎、蒲公英及其配伍抗?jié)兣c抗胃黏膜損傷作用與機制研究J中藥藥理與臨床，1991，7（6）：223朱蔚云，龐竹林，梁敏儀，等蒲公英對環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓細胞突變作用的抑制研究J癌變?畸變?突變，2003，15（3）：1644Takasaki M,Konoshima T,Tokuda H.et al.Anticareinogenie activit

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