不同低溫冷凍預(yù)處理對(duì)異體神經(jīng)移植再生影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、    不同低溫冷凍預(yù)處理對(duì)異體神經(jīng)移植再生影響的實(shí)驗(yàn)研究作者：鄒永根，蔣電明，邵智    作者單位：瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院骨科，四川 瀘州 646000；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016；重鋼職工醫(yī)院骨科，重慶 400080【摘要】 目的 觀察不同冷凍溫度下保存的異體神經(jīng)對(duì)周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的效果。方法 取96只同種屬雄性大鼠，其中24只為取材組，72只隨機(jī)分為對(duì)照組（A、B組）和實(shí)驗(yàn)組（C、D、E、F組），每組12只。A組為新鮮自體神經(jīng)移植組,B組為新鮮異體神經(jīng)移植組,C、D、E和F組分別為經(jīng)4、-

2、50、-80和-196甘油保存3周的神經(jīng)移植組。術(shù)后2周，進(jìn)行免疫組織化學(xué)觀察；術(shù)后9、16周進(jìn)行大體觀察、光鏡檢察、電生理測(cè)定。結(jié)果 術(shù)后2周， B組移植段見明顯T淋巴細(xì)胞浸潤，C、D、E組次之，A組及F組未見T淋巴細(xì)胞。術(shù)后9周及16周，從神經(jīng)再生效果評(píng)價(jià)看：A組神經(jīng)再生效果最好， F組次之，C、D、E組再次，B組最差。結(jié)論 在各冷凍組中，以 -196組神經(jīng)再生效果最好，接近新鮮自體神經(jīng)移植組?！娟P(guān)鍵詞】  低溫 神經(jīng)移植 周圍神經(jīng) 預(yù)處理Study of allogeneic neural transplantation after deep freeze pretreatme

3、nt                                                 

4、0;        ZOU Yonggen,JIANG Dianming,SHAO Zhi（Second Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou  646000,China)    Abstract：  Objective  To investigate the regeneration of peripheral nerve allografts stored in the glycerol of

5、different temperature.Methods  A total of 96 male Wistar rats,were randomly divided into 7 groups.Group A and B were the control groups,each of which included 12 rats;all underwent fresh femoral nerve autograft and allograft transplantation respectively.Twentyfour rats in group G were sacrifice

6、d to obtain 48 femoral nerves,which were randomly divided into 4 groups,12 nerves in each group,and were stored in glycerol for 3 weeks at 4, -50, -80 and -196 respectively.After storage for 3  weeks,4×12 nerves in each temperature group were randomly transplanted into 4×12 rats in ta

7、rget rats group C,D,E and F respectively.Two weeks after transplantation, two grafts of transplanted nerves in group AF were harvested randomly and examined with immunohistochemistry to observe the infiltration of lymphocyte to the grafts and regeneration of sciatic nerve and fiber.Nine and 16 weeks

8、 after transplantation,the regeneration of sciatic nerve was examined with histology,electrophysiology and with electron microscope.Results  Wallerian degeneration was observed in the proximal and distal ends of all grafts of nerves harvested at 2 weeks postengraftment; infiltration of T lympho

9、cytes at the grafts in group B was significant,less T lymphocytes were seen in group C,D and E,while no T lymphocytes were seen in group A and F.Collagenoblast proliferation was observed in group B,Schwann cell proliferation in group A and F,while both collagenoblast and Schwann cell proliferation w

10、ere observed in group C,D and E.Nine and 16 weeks postengraftment,grafts in group B were severely adhered to the adjacent tissue,adherence in group A and F were slight,while that of groups C,D and E came between.Nerve regeneration of group A was the best,group F came second,the next were groups C,D

11、and E,while group B was the worst.Conclusion  The  best  storage  temperature  is  -196.    Key  words：hypothermia;nerve allograft;peripheral nerve;pretreatment    周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)，尤其是對(duì)長段神經(jīng)干缺損的修復(fù)，其處理仍為臨床上較棘手的問題。自體神經(jīng)移植被公認(rèn)為是修復(fù)神經(jīng)缺損的最佳選擇，但自體可供移植的

12、神經(jīng)來源有限、還會(huì)給供區(qū)帶來功能損害，臨床應(yīng)用受到一定的限制。如何找到一種或者幾種合適方法的聯(lián)用，有效降低移植神經(jīng)的免疫原性、增加神經(jīng)纖維的再生能力，將對(duì)臨床上異體神經(jīng)移植的常規(guī)開展起到積極的作用。目前效果較為肯定的預(yù)處理方法是低溫冷凍，而保存在怎樣的冷凍條件下效果最好，同樣是我們所關(guān)注的。本研究的目的是用甘油做保存液，觀察在不同冷凍溫度下保存的異體神經(jīng)對(duì)周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的效果，以探求出最佳的冷凍溫度。材料與方法1  動(dòng)物與分組    健康同種屬雄性Wistar大鼠96只，月齡2月以上，體重（300±20）g。其中24只為取材組，72只隨機(jī)分為

13、對(duì)照組（A、B組）和實(shí)驗(yàn)組（C、D、E、F組），每組12只。A組為新鮮自體神經(jīng)移植組,B組為新鮮異體神經(jīng)移植組,C、D、E和F組分別為經(jīng)4、-50、-80和-196甘油保存3周的神經(jīng)移植組。2  主要儀器及試劑    顯微手術(shù)器械，冰箱（容聲，廣東）,雙目顯微鏡（奧林巴斯，日本）,病理組織包埋臺(tái)（BMZ型，蘇州）,超薄切片機(jī)（Rechert ltracut E型，德國）,電子顯微鏡（H-600，日本）,肌電檢測(cè)儀（KEY point V 3.22，Medtronic，美國）,小鼠抗大鼠CD4和CD8單克隆抗體(英國Serotec公司),兔抗人GAG單抗(

14、美國SantaCruz公司) ,生物素標(biāo)記的兔抗大鼠血清(美國Sigma公司) 。3  方法    3.5%水合氯醛1ml/100g腹腔麻醉。在大鼠股后外側(cè)行縱行切口；從梨狀肌孔下0.5cm處，用消毒剃刀片，切取神經(jīng)干1.0cm。取材組：取24只大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)干取下1.5cm長，本實(shí)驗(yàn)4組(4×12)神經(jīng)，置于37條件下，依次浸泡于50%、70%和85%的甘油中各3小時(shí)，再分裝在盛有85%甘油EP管中密封，分別置于4、-50、-80冰箱與-196液氮瓶中（采用分階段降溫措施，降溫速度11.5/min），保存時(shí)間均為3周。對(duì)照組A：將坐骨神經(jīng)取

15、下后立即移植給自體的對(duì)側(cè)；對(duì)照組B：將坐骨神經(jīng)取下后不作任何處理，立即相互交叉移植作為新鮮異體神經(jīng)移植。實(shí)驗(yàn)組C、D、E、F組：分別在3周后在隨機(jī)原則下將各組12條神經(jīng)分別移植給12只大鼠。4  觀察指標(biāo)    大體觀察；術(shù)后2周每組取2只大鼠做小鼠抗大鼠CD4和CD8單克隆抗體雙標(biāo)免疫組化；術(shù)后9周及16周，每組隨機(jī)抽取5只，做以下檢測(cè)指標(biāo)：組織學(xué)切片光鏡、神經(jīng)電生理、透射電鏡。5  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析    所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用q檢驗(yàn)，P0.05視為無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1&#

16、160; 大體觀察    術(shù)后2周，大鼠各實(shí)驗(yàn)足趾開始出現(xiàn)紅腫，潰瘍及糜爛；術(shù)后4周，大鼠實(shí)驗(yàn)趾脫落，其中足趾脫落情況以自體移植A組最輕，實(shí)驗(yàn)F組次之，B組最重；術(shù)后9周，A、F組潰瘍已愈合，C、D、E組仍可見小潰瘍且紅腫明顯，B組深大潰瘍?nèi)源嬖?，肌肉萎縮明顯；術(shù)后16周，A、F組已恢復(fù)近正常功能，C、D、E組無潰瘍，已恢復(fù)部分后蹬動(dòng)作，B組淺潰瘍紅腫存在，拖足行走。2  各組取材時(shí)移植體情況    術(shù)后2周取材見：A組近端腫脹，遠(yuǎn)端神經(jīng)吻合口為少量結(jié)締組織包裹，再植神經(jīng)段色白，表面有少量毛細(xì)血管；其余各組移植體周圍黏連明顯

17、，結(jié)締組織包裹，再植神經(jīng)段色白，表面未見毛細(xì)血管生長；B組黏連情況最重，F(xiàn)組情況略好，但仍重于A組。術(shù)后9周取材見：A組再植神經(jīng)段近端腫脹輕，遠(yuǎn)端吻合口與周圍組織黏連輕，再植神經(jīng)段色白，表面有大量毛細(xì)血管，呈網(wǎng)狀。F組情況與A組相近，B組再植神經(jīng)段近遠(yuǎn)端吻合口與周圍組織黏連重，再植神經(jīng)段大部分為纖維組織包繞。其余各組情況介于F組與B組之間。術(shù)后16周取材見：A組與F組情況很相近：再植神經(jīng)段近端接近正常，遠(yuǎn)端吻合口與周圍組織僅有少量細(xì)絲樣黏連，再植神經(jīng)段表面有大量毛細(xì)血管（圖1）。B組情況最差，神經(jīng)移植體部分為纖維組織替代，與周圍組織黏連在一起，再植神經(jīng)段無毛細(xì)血管生長。C、D、E組情況介于F組

18、與B組之間。3  免疫組化觀察    術(shù)后2周， CD4/CD8雙標(biāo)免疫組化結(jié)果：A組成纖維細(xì)胞較少，SC多，分布于變性神經(jīng)纖維周圍，排列規(guī)則，Wallerian變性明顯，未見T淋巴細(xì)胞浸潤；B組 Wallerian變性明顯，成纖維細(xì)胞很多，SC較少（圖2）每個(gè)視野均可見數(shù)個(gè)CD4/CD8T細(xì)胞亞群的浸潤（棕色受染近圓形核）；C組成纖維細(xì)胞增生可見，SC增生可見，排列較規(guī)則，Wallerian變性可見，偶可見散在單個(gè)CD4/CD8T細(xì)胞亞群的浸潤；D，E組結(jié)果基本同C組；F組成纖維細(xì)胞少，SC增生明顯，排列規(guī)則，可見數(shù)個(gè)典型沿變性神經(jīng)纖維周圍分布的“圈”

19、，Wallerian變性明顯（圖3），均未見T淋巴細(xì)胞浸潤。4  光鏡觀察    術(shù)后9周，取各組大鼠5只在200倍視野下見：A組移植段血管增生，有髓神經(jīng)纖維很多，SC增生很明顯，排列較規(guī)則，軸索變性，髓鞘溶解可見，淋巴細(xì)胞浸潤不明顯；B組移植段有髓神經(jīng)纖維少，SC可見，軸索變性，髓鞘溶解非常明顯，見淋巴細(xì)胞浸潤明顯；C組移植近端，有髓神經(jīng)纖維較少，SC增生較明顯，軸索變性，髓鞘溶解明顯，淋巴細(xì)胞浸潤不明顯；D和E組同C組相似；F組移植段近端，有髓神經(jīng)纖維多，SC增生很明顯，軸索變性，髓鞘溶解可見，淋巴細(xì)胞浸潤不明顯（圖4）。5  電鏡觀察&#

20、160;   神經(jīng)移植術(shù)后9周，取各組大鼠2只，取移植體近端0.5cm送透射電鏡檢查，各組均見神經(jīng)纖維再生：A組再生纖維數(shù)量多，髓鞘成熟，發(fā)育完善，髓鞘旁可見SC，軸漿均勻，豐富；B組再生纖維數(shù)極少，Wallweian變性嚴(yán)重，軸漿萎縮明顯，幾乎不能見；C組再生纖維數(shù)量較多，Wallerian變性可見，較廣泛，軸漿萎縮較明顯；D和E組與C組相近；F組再生纖維數(shù)量較多，髓鞘較成熟，發(fā)育完善，髓鞘旁可見少量SC及髓鞘互相包繞影，軸漿較均勻（圖5），與A組相近。6  神經(jīng)電生理測(cè)定    術(shù)后9周統(tǒng)計(jì)分析：A組與B、C、D、E組相比，P&l

21、t;0.05，表明有統(tǒng)計(jì)差異性;F組與B、C、D、E組相比，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合F組潛伏期較短，傳導(dǎo)速度快，可見F組再生神經(jīng)功能優(yōu)于B、C、D、E組（見表1）。    術(shù)后16周統(tǒng)計(jì)分析：A組與B，C，D，E組相比，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;F組與B，C，D，E組相比，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A組與F組相比，P>0.05，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即術(shù)后16周，A、F組在潛伏期和傳導(dǎo)速度上非常接近，再生神經(jīng)功能接近（見表2）。表1  術(shù)后9周各組再生神經(jīng)傳導(dǎo)速度及潛伏期結(jié)果（略）表2  術(shù)后16周電生理各

22、組再生神經(jīng)傳導(dǎo)速度及潛伏期結(jié)果（略）圖1  F組16周移植體情況（略）圖2  B組移植體近端橫切面形態(tài)結(jié)構(gòu)（免疫組化×400，2周）（略）圖3  F組移植體近端橫切面形態(tài)結(jié)構(gòu)（免疫組化×400，2周）（略）圖4  F組移植體近端橫切面形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE×200，9周）（略）圖5  術(shù)后9周F組掃描電鏡圖(×3500)（略）討論1  免疫排斥反應(yīng)與雪旺氏細(xì)胞    現(xiàn)在，較多的證據(jù)已表明異體神經(jīng)移植物中的主要抗原成分大多存在于細(xì)胞成分中，在現(xiàn)代移植免疫學(xué)中，這種細(xì)胞是指移

23、植物中可遞呈抗原并表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子、激活異種抗原識(shí)別的細(xì)胞，在周圍神經(jīng)中則主要是雪旺氏細(xì)胞(Schwann cell，SC)。SC是排斥反應(yīng)的主要目標(biāo)，具有加工外源性抗原的能力，表達(dá)MHC抗原；而且SC還可產(chǎn)生淋巴因子，如干擾素（INFr）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素(IL1，IL12)，激活巨噬細(xì)胞的功能，直接參與排斥反應(yīng)。SC能產(chǎn)生神經(jīng)生長因子(NGF)，這類神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)傷后神經(jīng)的再生有重要作用。本實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后2周行免疫組化檢察，可清晰見到B組T淋巴細(xì)胞的浸潤；A、F組未見到T淋巴細(xì)胞；C、D、E組單個(gè)視野偶爾可見單個(gè)T細(xì)胞。經(jīng)深低溫預(yù)處理的F組（-196

24、組）抗原性明顯減低，更利于宿主SC細(xì)胞再生。移植后9周的電生理結(jié)果顯示：F組（-196組）潛伏期為（1.3105±0.0291）毫秒，神經(jīng)傳導(dǎo)速度為（13.0223±0.9529）m/s，與C、D、E組相比有顯著性意義（P<0.05）,即F組優(yōu)于C、D、E組，術(shù)后9周光鏡及電鏡結(jié)果也得到同樣的結(jié)論。術(shù)后16周電生理結(jié)果顯示A組與F組在潛伏期和傳導(dǎo)速度上非常接近，再生神經(jīng)功能無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2  常用保存液有以下幾種    近年來國內(nèi)外學(xué)者常用的異體神經(jīng)保存液有：綠茶多酚1(green tea polyphenols,GTPs)&#

25、160; ，冷凍血漿，乙醇，甘油等。甘油作為同種異體神經(jīng)移植的預(yù)處理液有如下優(yōu)點(diǎn)：制作簡便，保存方便，費(fèi)用低廉，并可長期保存。國內(nèi)學(xué)者2實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)甘油預(yù)處理的異體神經(jīng)，其抗原性能顯著降低。機(jī)制是：逐級(jí)將神經(jīng)脫水，不僅能破壞SC從而降低其免疫原性，而且能完好的保存神經(jīng)內(nèi)的SC基膜管，使其不致皺縮、變形，為再生神經(jīng)纖維提供良好的通道。同時(shí)85%甘油有很好的滅菌作用，能預(yù)防感染發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)4組(4×12)神經(jīng)，置于37條件下，依次浸泡于50%、70%和85%的甘油中各3小時(shí)，再分裝在盛有85%甘油EP管中密封，分別置于4、-50、-80與-196液氮瓶中（分階段降溫，降溫速度11.5/mi

26、n），較好的保持了凍存細(xì)胞的活力和功能，保存3周后行神經(jīng)移植。且術(shù)后實(shí)驗(yàn)各組大鼠無1例感染，也說明了經(jīng)甘油預(yù)處理后的移植神經(jīng)能有效預(yù)防感染。3  冷凍損傷    低溫凍存是保存活體組織的重要方法，冷凍損傷是活體組織細(xì)胞經(jīng)冷凍后最重要的副反應(yīng)。損傷機(jī)制主要是凍融時(shí)冰晶對(duì)細(xì)胞的機(jī)械性和滲透性損傷，表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面3：（1）慢速冷凍過程中，細(xì)胞外液水分不斷結(jié)晶造成游離水分減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不等，使得大量水分由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外滲出，逐漸導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，造成“溶質(zhì)性損傷”。（2）快速冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)水分尚未轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，而細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)結(jié)冰，細(xì)胞內(nèi)冰晶

27、機(jī)械性破壞細(xì)胞器和細(xì)胞核而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，造成“細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷”。目前認(rèn)為生物組織的冷凍損傷主要是“溶質(zhì)性損傷”所產(chǎn)生的滲透壓、電解質(zhì)含量和pH值的改變作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)造成的細(xì)胞膜滲漏，在復(fù)溫過程中，細(xì)胞膜滲漏使大量水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞水腫而死亡，稱為滲透性休克4。此外，復(fù)溫過程中如復(fù)溫速率較慢，則會(huì)再次形成冰晶，加重細(xì)胞損傷。由于冷凍速率越快引起細(xì)胞內(nèi)冰晶形成越多，而速率過慢又可導(dǎo)致“溶質(zhì)性損傷”。因此，低溫保存需要選擇造成損傷最輕的降溫速率。此外，復(fù)溫速率對(duì)低溫保存后細(xì)胞活力的恢復(fù)有很大影響，嚴(yán)格說復(fù)溫過程是降溫過程的逆函數(shù)。如果沒有足夠快的復(fù)溫速率，細(xì)胞內(nèi)再次形成冰晶的概率很高。為了減輕冷凍損傷，選擇適宜的降溫和復(fù)溫速率是低溫保存的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。分階段降溫比勻速降溫對(duì)細(xì)胞活力和功能影響小，因此本實(shí)驗(yàn)采用分階段降溫措施，降溫速度11.5/min5，冷凍時(shí)間以3周為宜6，3周后于37水箱中快速復(fù)溫，較好的保持了凍存細(xì)胞的活力和功能。    冷凍保存異體神經(jīng)有降低其免疫原