熒光定量入門

1、實時定量PCR應用中的問題及優(yōu)化方案聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction , PCR）自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進行精確定量的有力工具1。隨著分子生物學技術研究的不斷進展，定量PCR技術取得了突飛猛進的發(fā)展，不僅建立了一系列的方法，而且也誕生了許多與這些方法相匹配的新型熱循環(huán)儀和實驗材料。實時定量PCR(real-time quantitative PCR)技術便是一種具有革命性意義的定量PCR技術，所謂實時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測 熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的

2、量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量2。目前它作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-time PCR為關鍵詞的文章就達一千多篇。實時PCR技術較之與以前的以終點法進行定量的PCR技術具有無與倫比的優(yōu)勢。首先，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進行操作。另外，它還可以通過不同的引物設計在同一反應體系中同時對多個靶基因分子進行擴增，即多重擴增3,4,5。本文將對實時定量PCR目前的應用狀況、儀器應用、新材料

3、進展以及實驗條件的優(yōu)化作一綜述。實時定量PCR的應用現(xiàn)狀實時定量PCR技術自1996年誕生以來，由于它顯著的優(yōu)越性，不僅廣泛的應用于分子生物學的各個研究領域，而且也開始作為一種診斷手段應用于臨床。其應用涉及到的范圍包括DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態(tài)性分析，基因突變分析等多個領域3。Giulietti 等人6對用實時定量PCR測定細胞因子基因的表達作了詳細的描述。細胞因子是一種調(diào)節(jié)蛋白，它對免疫反應、炎癥反應具有重要的調(diào)節(jié)作用，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的關系。由于所得到組織樣本常常因為太小而不能滿足在蛋白質(zhì)水平的檢測，另外，通常用的蛋白質(zhì)

4、檢測方法（如ELISA）的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產(chǎn)物的檢測，所以應用PCR定量進行基因診斷就顯得十分有意義。 眾所周知，cDNA微排列和差異表達PCR技術是對基因表達變化分析的兩種關鍵技術，但是這兩種技術只能對基因表達變化進行定性分析，而不能進行定量分析。Rajeevan等人7利用實時定量PCR技術卻成功地將基因表達的變化進行了量化，不僅有效地證明了上述兩種方法的有效性，而且提供了一種具有高通量的對基因表達變化進行檢測的新技術。實時定量PCR技術的出現(xiàn)不僅增強了有關對基因量變化的研究方法，而且也增強了對基因質(zhì)所發(fā)生變化方面的研究。例如Laird和他的同事們8建立了一種被稱作Methyl

5、ight的實時定量PCR方法，它能通過特異的引物和/或Taqman探針檢測基因CpG島的胞嘧啶是否發(fā)生了甲基化。由于實時PCR的敏感性和特異性，使得這種方法對胞嘧啶的過度甲基化常常具有極高的靈敏度。最近有研究表明這種方法可以從食管癌病人的食管粘膜中檢出含有發(fā)生了過度甲基化基因的細胞9。又如Sevall等人10證明可以用實時定量PCR方法區(qū)分含有突變的等位基因。這是利用兩種不同的熒光報告基團標記Taqman探針，該探針既可同野生型基因又可同突變型基因發(fā)生雜交，由于探針的雜交效率及隨后的切割是由雜交決定的，所以如果出現(xiàn)一種信號強于另一種信號則表明兩條基因具有同源性，若兩種信號都增強則表明為異源性。

6、目前實時定量PCR在臨床診斷方面的應用主要體現(xiàn)在對感染組織或細胞負載病毒的定量測定上，這一技術對DNA和RNA病毒都可以檢測，目前已有標準的操作手冊供人們使用，但是必須明確，國際上既沒有統(tǒng)一的病毒荷載的標準，也存在著對其標準曲線和定量準確性的各種爭論。這里值得一提的是一種稱為NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技術11，它是一種利用電化學以光的等溫PCR反應，在反應過程中能產(chǎn)生一種與靶RNA反極性的RNA擴增子，分子beacon常用于這種技術 ，這種方法常常用于對逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量測定。常用的熱循環(huán)儀對PCR產(chǎn)物進行實時定量的測定之所

7、以能成為現(xiàn)實，并且應用如此廣泛，其中一個重要的原因就是新的熱循環(huán)儀的研制與推廣。目前，國內(nèi)外常用的熱循環(huán)儀主要有以下幾種：1. PE公司生產(chǎn)的Applied Biosystem系列：(1) ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一種作為商業(yè)用途的實時PCR測定儀，它由激光激發(fā)熒光，并且可在500-660nm范圍內(nèi)調(diào)節(jié)波長，可以用于基于水解探針、雙鏈DNA結(jié)合染料、分子beacon原理的分析。一次可以測定96個樣本，并且速度較快，一批樣本的完成只耍要2小時。但是它不能實時對擴增結(jié)果進行分析，而只能在全部擴增結(jié)束后才進行數(shù)據(jù)分析。(2) G

8、ene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作與 ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用鹵素燈為激發(fā)光源，而且只設計了一個檢測波長。(3) ABI Prism 7900 SDS: 這是一種為實現(xiàn)高通量檢測而設計的儀器，其基本構(gòu)成與ABI Prism 7700 SDS相同，但程序設計完全實現(xiàn)自動化要求，而且有兩種樣品盤可供選擇（96孔和384孔）。如果加上一個裝載輔件，可以在24h之內(nèi)完成84個384孔板的樣本測定。2. Roche 公司生產(chǎn)的Lightcycler熱循環(huán)儀，它以能裝載20-25ul的毛細硅管作為反應管進行擴增，光源選用冷光源系統(tǒng)，可以減少光源對樣本的

9、影響。由二極管發(fā)射藍光激發(fā)熒光，并提供三個濾光片，可利用熒光分光測定的原理，同時對一個反應體系的多種熒光進行檢測，所以它完全可以進行多重PCR。由于Lightcycler使用了其獨特毛細管反應體系和空氣快速熱循環(huán)系統(tǒng)，使樣本能在非常短的時間內(nèi)有效地實現(xiàn)溫度變化，從而能在20-30min內(nèi)快速完成30-40循環(huán)，達到樣本擴增的目的12。Lightcycler通常使用的實驗材料主要是SYBRI Green I熒光染料和Taqman熒光探針和雜交探針。雖然Lightcycler有相當多的優(yōu)點，但是這也有一些不足之處，由于它只提供一個32孔的樣品盤，這使得不能在一次進行較多的樣本測定。3. Bio-r

10、ad 公司生產(chǎn)的iCycler iQ：這種儀器提供連續(xù)的檢測波長調(diào)節(jié)，程序滿足實時數(shù)據(jù)處理，可以同時在一個反應體系中檢測四種熒光信號，由于一批能完成96個樣本的測定，所以能提供相對較快的擴增反應。4. Strategene公司的MX4000 Multiplex: 這種儀器的檢測波長可在350-750nm范圍內(nèi)進行調(diào)節(jié)，以鹵素燈作為激發(fā)光源，常選用的實驗材料包括Taqman探針、雜交探針和分子信標（molecular beacon），其樣品盤的規(guī)格有多處可供選擇，包括96孔盤、8聯(lián)管或單管，其程序也提供實時數(shù)據(jù)分析。5. Cepheid公司的Smart Cycler System: 這種儀器正如

11、其名一樣具有強大的功能，它有16種反應模式可供選擇，而且每種模式都有各自的程序，任一模式不僅能同時檢測四種熒光信號，而且不同的使用者可對同一批樣品同時運行不同的模式進行檢測。Smart Cycler System的這種設計雖然有其優(yōu)點，但是其缺點也是顯而易見的，由于其將樣品盤分得過細，所以不利于同時進行較多樣品的分析。6. Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 這種儀器與Lightcycler相比，屬于中心型熱循環(huán)儀，即從反應體系內(nèi)部進行熱變化；其具有雙光源系統(tǒng)，藍光在470nm處激發(fā)熒光，綠光在530nm波長激發(fā)熒光；具有兩種樣品盤（32孔和72孔）供選擇；可以對多

12、種熒光材料進行測定 。熒光材料新進展為了滿足實時PCR更高敏感性要求，各試劑公司都致力于開發(fā)新型的化學發(fā)光材料，目前作為商業(yè)用途的這些化學物質(zhì)都能適用于上述的各種儀器。它們主要有以下幾種：1. 水解探針或Taqman探針：這種探針用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5à3活性所降解，探針的5端有一熒光報告基團，3端有一熒光淬滅基團，當兩個基團相互先靠近的時候，由于發(fā)生能量傳遞作用，報告基團不能發(fā)出熒光，但隨著擴增反應的進行，5端的報告基團隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅發(fā)生能量傳遞作用，從而能發(fā)出熒光，被信號探測器所捕獲。常同探針5端相結(jié)合的基團有FAM（

13、6羧基熒光素）,TET（四氯6羧基熒光素）,JOE（2，7二甲基4，5二氯6羧基熒光素），HEX（六氯6甲基熒光素）或VIC，常與3端相結(jié)合的熒光淬滅基團常為TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或DABCYL（4-（4-惡烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相較之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的減少自發(fā)熒光信號6。目前，水解探針已被用于基因檢測13、病毒定量14,15、癌細胞基因微突變檢測16、細胞因子基因定量17等，其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性。2. 分子信標: 是一種單鏈DNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其一端有一報告基團，在另一端有一淬滅基團18，當它形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，由于熒光報告基團與淬滅基團想

14、互靠近，兩者之間發(fā)生熒光信號能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescent resonance energy transfer FRET），當熱循環(huán)溫度達到分子beacon的解鏈溫度時，其構(gòu)象發(fā)生改變，能與模板結(jié)合而完全伸展成線性分子，使得FRET消失，報告基團發(fā)出熒光信號19,20。分子信標特別適用于檢測點突變，這能區(qū)分只有一個核苷酸差異的不同DNA序列，而且其敏感性要遠比同等長度的寡核苷酸探針高21,22，分子beacon已被用于突變檢測23,24、病原體定量25,26、病毒檢測27和胚胎的性別判斷28，它同時出用于多重PCR檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒29。3. scorpions: 它由兩個寡核苷酸分子組成，

15、一個是引物，另一個是帶熒光分子的探針，但是此探針也具有引物的功能30。引物與形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針相連，在探針上由于熒光報告基團與淬滅基團相互靠近，不能發(fā)射熒光。在反應的變性階段，探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)會解開，構(gòu)象發(fā)生改變，在退火時則與模板相結(jié)合，形成線性分子，報告基團同淬滅基團分離而發(fā)射熒光。同Taqman探針和分子beacon相比，scorpion能更快地發(fā)射出熒光且信號更為強烈31，其特異性也很高，因為只有在反應體系中存在特異的目的基因，探針-引物才會與之相結(jié)合。Scorpion是一種較新的熒光材料，具有良好的應用前景31。4. 雜交探針：該材料使用四個寡聚核苷酸分子，兩個引物與兩個探針，雜交探針分

16、別單標，一個攜帶熒光供體基團，一個攜帶熒光受體基團，當這兩個探針雜交到目的基因上時，能形成首尾相連的結(jié)構(gòu)使兩個熒光基團相互靠近，發(fā)生FRET。受體基團能轉(zhuǎn)移能量，使得供體基團在不同波長條件下被激發(fā)，發(fā)射出的熒光量直接與目的基因的產(chǎn)量成相關關系32。這一方法已被Roche公司生產(chǎn)的Lightcycler所應用，進行病原體檢測33、病毒荷載量34的測定等領域。5. SYBR Green I: 這是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光35。它的最大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應體系中，從經(jīng)濟角度

17、考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多，但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應體系中出現(xiàn)非特異擴增，那它就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復性36。要避免這種不利因素，一方面可以通過Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等熱循環(huán)儀內(nèi)設定的程序過對擴增曲線進行分析，以區(qū)分由PCR產(chǎn)物和本底造成的熒光信號，另一方面就是選擇良好的引物和探針并優(yōu)化反應條件以消除非特異性影響37。實踐中的問題：實時定量PCR已廣泛地運用于分子生物學的各個領域，就目前的應用情況來看，雖然取得了很好的效果，但是其在方法學上的選擇、敏感性問題、重復性問題等都一直是爭論不休的，本文將就這些問題做

18、出探討。1. 方法的選擇：研究者在實驗中往往想要得到目的基因的絕對量，因為絕對定量對目的基因的表達差異有直接的反映38。絕對定量最為簡單的方法就是標準曲線法，用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在同等條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質(zhì)粒dsDNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA39。目的基因與標準品在不同的反應管內(nèi)同時進行擴增，使用的熒光材料可以是雜交探針、水解探針或是SYBR Green I。有研究表明40，這一方法的動力學范圍可以達到9個數(shù)量級，遠比終點法的要高。這一方法雖然簡便，但是為了得到可靠的實驗結(jié)果，有兩個

19、先決條件必須等到滿足，一是所選用的標準品必須與目的基因的擴增效率一致，要達到這個要求，需要標準品同目的基因的同源性盡可能的高，不僅長度相似，而且其堿基組成也盡量相同；二是要盡可能地優(yōu)化實驗條件和模板的準備過程。就標準品而言，實踐中有外參照和內(nèi)參照之分，作為外參照的標準品與目的基因不在同一反應體系中進行擴增，所以它無法檢測也不可能補償可能出現(xiàn)在目的基因反應體系中的影響因素，如PCR抑制子41。事實上，在絕大多數(shù)的實驗中，要想使標準品和目的基因的擴增效率完全一致是不可能的。為了彌補單獨使用一個標準品作為外參照的不足，研究者便引入一個內(nèi)參照同目的基因在同一反應體系中同時進行擴增，以反映體系中可能出現(xiàn)

20、的PCR影響因素，此即所謂的競爭性PCR。競爭性PCR 所使用的內(nèi)參照具有與目的基因序列相同的引物結(jié)合位點，但不具有相同的探針結(jié)合位點42。關于內(nèi)參照的設計，有多種方法可供選擇，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突變43，改變目的基因中的某些核苷酸44，設計不同的限制性酶識別位點45，也可以用非特異的間隔基因或間隔DNA 作為內(nèi)參照46。競爭性PCR 設計的原理在于內(nèi)參照與目的基因相互競爭反應的原料，所以兩者的量應當相互匹配，如果一方的拷貝數(shù)大大的高于另一方，那么拷貝數(shù)多的一方就會在反應體系中得到優(yōu)先擴增，而拷貝數(shù)少的一方則擴增受到抑制，定量也就不能有效地進行。由于使用了內(nèi)對照，所以一旦體系中

21、存在干擾PCR擴增的因素，就會通過內(nèi)對照的擴增效率的變化反映出來，目前使用的實時定量PCR儀都是以擴增曲線上crossing point的漂移來體現(xiàn)擴增效率的變化的。競爭性PCR 由于能夠消除反應體系中干擾因素的影響，所以它所等到的結(jié)果要準確可靠得多，但是由于在反應體系中同時擴增兩種模板，使得其結(jié)果的測定范圍比單使用外參要大為縮小，往往只有2-3個數(shù)量級40。正是由于競爭性PCR 有利有辟，所以研究者應根據(jù)不同的情況決定是否使用內(nèi)參照。在目前的研究中，大多數(shù)研究者選擇使用絕對定量的方法，但是也有學者47認為在當前的條件下，絕對定量具有難以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀釋濃度的標準品不

22、僅費時費力，而且也有相當多的問題，目前廣泛使用的在260nm波長下定量的方法與眾多因素有關，如水、緩沖液、儀器性能，乃至于核酸的抽提過程都會影響到結(jié)果的穩(wěn)定性。（2）標準品的穩(wěn)定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質(zhì)易于被降解，而每次配制新的標準品又會增加批間差異。（3）每次測定樣本都要同時測定標準品，而熱循環(huán)儀的樣本孔往往有限，所以使得不能在單批內(nèi)測定更多的樣本，這樣也就使實時PCR 的高通量有所降低。（4）由于樣本來源存在極大的差異，所以很難保證標準品與目的基因的擴增效率一致。這樣會大大增加結(jié)果的變異，即使是各樣本的DNA（或cDNA）有極小的差異或模板片斷不均一，都會對定量的結(jié)果造成很大的差

23、異。鑒于以上原因，這些學者強烈地推薦使用相對定量的方法，所謂相對定量是指在測定目的基因的同時測定某一內(nèi)源性管家基因，該管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較；（2）作為內(nèi)源性對照補償待測樣本的體積變異、核酸抽提過程中造成的目的基因變異，以及反映反應體系內(nèi)是否存在PCR擴增的影響因素；（3）標準化標本47。由于管家基因在各種組織中是恒定表達的，所以可以以管家基因的定量來作為某種標準以比較樣本來源不同的目的基因表達量的差異。通常選用的管家基因有GAPDH 、-actin、2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根據(jù)具體的需要而選定合適的管家基因。使用的相對定量較為早期的方法是用一系列已知外參物

24、做標準曲線，根據(jù)該標準曲線得到目的基因和管家基因的量，再將目的基因的同管家基因的比值作為定量的最后結(jié)果。這一方法要求外參、目的基因和管家基因的擴增效率一致。除了這種常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen48設計了一種比較閾值法來測定目的基因的相對表達，他們根據(jù)數(shù)學推導得出目的基因的量=2-Ct，在該公式中，Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值，Ct=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)實驗組-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)對照，所以，2-Ct表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量，而不必制作標準曲線，

25、所以這一方法更為簡便省時。統(tǒng)計學結(jié)果表明這一方法的結(jié)果也是相當可靠的?？傊?，相對定量不僅比絕對定量更加簡單，經(jīng)濟（如果不做標準曲線），而且也更為可靠和準確，因為存在于反應體系中的干擾因素，如樣本不純、試劑影響等都可以通過數(shù)學處理而去除。2. 重復性問題：重復性是判斷實驗結(jié)果優(yōu)劣的重要指標，其主要判斷指標為標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）。對于特定的分析系統(tǒng)，重復性的高低決定了PCR反應能檢測出樣本中目的基因的初始濃度變化的最小值。由于PCR反應本身具有不精確擴增的特性，它所造成的結(jié)果精確性要遠小于經(jīng)典的臨床化學檢驗和免疫分析。對于絕大多數(shù)實驗，一般都可以計算出所設計體系能檢測出樣本初始濃度的最

26、小值，根據(jù)多次實驗可以求得該最小值的變異情況和它的可信區(qū)間范圍，變異越小或是可信區(qū)間范圍越小，說明這一反應體系的精確度越高。在實時定量PCR過程中，從樣本的準備到擴增，再到定量的進行，實驗中的每個方面都與實驗的重復性息息相關，除了加樣的準確性和實驗所選用的儀器固定參數(shù)的限制之外，影響結(jié)果重復性較為關鍵的因素還包括（1）PCR 反應擴增的效率，如果在反應體系中擴增效率不一致，就會影響到目的基因在單位時間內(nèi)的產(chǎn)量發(fā)生差異，從而影響到結(jié)果的穩(wěn)定，要解決這個問題，必須盡量優(yōu)化實驗條件，使反應體系達到最佳擴增效率。（2）目的基因的初始濃度，初始拷貝數(shù)越低，結(jié)果的重復性越差，為了保證獲得精確的結(jié)果，應使用

27、初始濃度具有較高數(shù)量級的樣本，如果待測樣本中目的基因的量處于反應體系的檢出限附近，那么最好是使用復孔以保證結(jié)果的可靠性。（3）標準曲線的影響，對于必須進行絕對定量的研究，標準曲線是必不可少的，雖然標準品和樣本之間的差異始終存在，但是制作一個好的標準曲線對定量結(jié)果至關重要，在制作標準曲線時，應至少選擇5個稀釋度的標準品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍，理想的標準品應與樣本具有高同源性，最好是選擇純化的質(zhì)粒DNA 或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA（用于RT-PCR），在制備過程中，應使用規(guī)范的步驟或是根據(jù)所購買的試劑盒提供的標準操作手冊進行。3. 敏感度問題：實時定量PCR 由于使用了熒

28、光物質(zhì)作為定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人47報導實時定量PCR 的敏感性要高出傳統(tǒng)的終點定量PCR 大約250倍。在理論上，只要設計的引物對目的基因有足夠的特異性，PCR 應可檢測出只含一個拷貝目的基因的樣本，也的確有人報導在特定的反應條件下，實時定量PCR 可以檢測出單細胞水平的基因組DNA11，但是在大多數(shù)情況下，對基因組DNA而言，它的最低檢出限一般在pg到fg級，對于病毒、質(zhì)粒而言，其檢出限一般在102-103拷貝數(shù)以上8。影響實時定量PCR 敏感性的因素眾多，除了對一般PCR反應均存在的影響因素如反應體系、Taq酶的活性之外,實時定量PCR還有其特殊的影響因素，包括：(

29、1)反應體系中形成的引物二聚體的影響：引物二聚體是非特異性退火和延伸的產(chǎn)物,它的形成不僅會影響到擴增的效率,而且由于SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合,所以會在反應體系中出現(xiàn)特異性產(chǎn)物與引物二聚體競爭SYBR Green I的現(xiàn)象,從而降低了實時PCR的敏感性。要解決這個問題，有多種方案可供選擇，首先可以用水解探針代替SYBR Green I，雖然水解探針并不能消除引物二聚體的形成，但是在定量檢測時，它卻可以避開引物二聚體的干擾，專一地測定來自于特異產(chǎn)物的熒光信號，有文獻報導使用水解探針的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用熱啟動辦法，所謂熱啟動是指在反

30、應體系達到引物退火溫度時才加入某一反應成分，因為引物二聚體的是在各種試劑一經(jīng)混合便開始形成的，所以用這種方法能有效地減少引物二聚體的形成，另外Lightcycler提供一種Taq酶的抗體，在PCR反應的最初階段，這種抗體能阻斷Taq酶的作用，但是當反應溫度達到70度時，它便失活，使Taq酶開始發(fā)揮作用，在反應體系中加入這一抗體的目的也就是使要在反應達到較高溫度時，才開始PCR擴增，從而避免反應初始階段引物二聚體的形成。第三，要盡可能地優(yōu)化引物設計，例如所設計的兩條引物不能互補（尤其在3端），使兩條引物的GC含量大致一致，使用純化的引物進行實驗等，這些都是防止引物二聚體形成的根本因素。第四，如果

31、反應體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應適當將目的基因的濃度稀釋后再進行擴增。最后，在實驗過程中應當注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開始進行擴增。（2）循環(huán)數(shù)：一般的實時定量PCR反應只須2530個循環(huán)便可獲得滿意的結(jié)果，但是對于那些極微量的待測樣本而言，適當增加循環(huán)數(shù)可以提高反應的檢出限，有文獻報導當循環(huán)數(shù)從25增加到34個循環(huán)時，實時定量PCR的最低檢出限可從106增加到103。但是并非循環(huán)數(shù)增加得越多，其敏感性就會越高，實際上，當循環(huán)數(shù)增加到某一值時，敏感性便不再升高，因為循環(huán)數(shù)并不是影響敏感性的唯一因素，而且在實驗過程中，也不可能因為增加敏感性而無限制地增加循環(huán)數(shù)，這不僅是實踐

32、中行不通，而且在理論上也不可行，因為隨著循環(huán)數(shù)的增加，一方面，聚積的產(chǎn)物會抑制Taq酶的活性，另一方面，也會增加形成異源二聚體的可能性，這些都會影響到最終的定量結(jié)果。（3）Mg2的濃度：根據(jù)Roche公司的Lightcycler3.5版本技術說明，Mg2+的濃度將影響到實時定量PCR的敏感性，其推薦使用的濃度為3mM。Mg2+濃度對敏感性的影響主要存在于兩方面，首先，Mg2+是影響Taq酶活性的關鍵因素，如果Mg2+的濃度無法達到使Taq酶發(fā)揮最佳活性，無疑將會影響到實時定量的敏感性；其次，Mg2+的濃度過高，會增加引物二聚體的形成，從而導致敏感性降低。所以在反應中選擇合適的Mg2+濃度條件，

33、是相當重要的。實驗方案優(yōu)化：由于各家公司生產(chǎn)的熱循環(huán)儀提供的各種實驗方案不太一致，所以優(yōu)化的策略也不盡相同，然而在各種方案中，前文所述的那些影響實時PCR 反應的因素卻總是相通的。只要能較好地控制實驗條件，優(yōu)化實驗步驟，要想獲得滿意的實驗結(jié)果并不一定都是困難的。下面本文將就影響到實驗結(jié)果的一些基本參數(shù)和實驗步驟談一談關于實時定量PCR的優(yōu)化。1. 基本參數(shù)的優(yōu)化：1.1 MgCl2的濃度 在PCR反應中，MgCl2的濃度對影響酶的活性是至關重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應中得到較低的Cp(crossing point)值，較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選

34、擇應慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應，應選擇25mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RTPCR而言，則應選擇的濃度為48mM。1.2 模板的濃度：如果研究者是進行首次實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度（高和中、低濃度）來進行實驗。一般而言，使Cp位于1530個循環(huán)比較合適，若大于30則應使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經(jīng)驗上是SYBR Green I探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。 2. 使用SYBR Green

35、 I測定DNA時的條件優(yōu)化：2.1 MgCl2的濃度：大多數(shù)引物模板對其的要求是24 mM。2.2模板的濃度：初次實驗要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定?；蚪MDNA在50ng-5pg之間選擇，質(zhì)粒DNA在106拷貝數(shù)左右選擇。2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進行稀釋，但是在某些條件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達到好的效果，反會使反應的敏感度降低，所以，研究者若要進行實時定量PCR研究，最好選用純化的模板。2.4 引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應的關鍵因素，其濃度太低，會致使反應不完全，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生

36、非特異的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應，0.5uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.31.0uM之間進行選擇，直至達到滿意的結(jié)果。2.6 退火溫度：首次實驗設置的退火溫度應比計算得出的Tm值小5，然后在12內(nèi)進行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗來確定，這個經(jīng)驗值往往會同計算得到的Tm值有較大的差距。3. 用SYBR Green I進行一步法RTPCR的條件優(yōu)化：3.1 MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在48mM之間選擇。3.2模板的濃度：RTPCR實驗既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度，可以

37、增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進行測定。3.3對照設置：每一引物都應設有陰性對照，陽性對照和污染對照。4. 雜交探針測定DNA4.1 MgCl2的濃度：在24mM的基礎上加0.51.0mM，但是不要超過2.0mM。4.2雜交探針的濃度：初次實驗每個探針用0.2uM，如果信號強度達不到要求，可以增加至0.4uM。4.3對照設置：每一引物都要設陰性對照，每一探針都要設陰性對照。每次實驗都要設陽性對照。4.4 其它的條件同SYBR Green I。5 用雜交探針實時定量RTPCR：5.1 MgCl2的濃度：在48mM之間進行選擇。5.2雜交探針的濃度：初實驗用0.2 u

38、M，如果熒光信號強度不足，可以增加至0.4uM。5.3模板濃度設置：優(yōu)化的擴增須進行一系列知釋度的實驗，在條件有困難的條件下，至少要進行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過小（小于10ng/ul）,則可加入MS2或alternative RNA作為載體。5.4 對照設置：每個引物都要設無模板對照，陽性對照以及污染對照。6.關于雜交探針的評價：在使用雜交探針進行實驗時，必須注意防止探針引物二聚體的形成和其本身在反應過程中的延伸。引物探針二聚體的形成，主要是因為探針可與引物的3末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴增，從而同目的基因競爭反應的原料，致反應的效

39、率下降。探針其本身能同目的基因相結(jié)合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實驗結(jié)果。鑒于以上這兩點，所以應對探針精心設計，并將其末端完全磷酸化。目前的實時定量PCR技術進展迅速，本文是結(jié)合本實驗室的工作經(jīng)驗以及文獻資料寫成的，文中提到的一系列方案、實驗材料和儀器設備都有其各自的優(yōu)缺點，也有各自的使用范圍，不能一概而論。所以不論研究者想進行何種研究，都應根據(jù)自己的情況首先找到適合自己研究目的的條件，本文僅供有意于運用實時定量PCR進行研究的人員參考

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