豬分泌型免疫球蛋白A(sIgA)酶聯(lián)免疫分析

1、豬分泌型免疫球蛋白A(sIgA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號：CSB-E12063p檢測范圍：7.8 ng/ml - 500 ng/ml最低檢測限：1.95 ng/ml特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測天然或重組的豬sIgA，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。有效期：6個(gè)月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定豬血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中sIgA含量。說明 1試劑盒保存：-20（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8（頻繁使用時(shí)）。2濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 3中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。4剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)

2、象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。概述 分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A，sIgA)是Chodircker和Tomas等在60年代初首先在人外分泌液中發(fā)現(xiàn)的一種IgA類抗體，它與血清中IgA無論在理化性質(zhì)或免疫學(xué)性質(zhì)上均不相同。sIgA 是黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，主要存在于淚液、唾液、乳汁和呼吸道、消化道及泌尿生殖道等黏膜表面分泌液中。粘膜的表面存在著分泌性免疫(Secretory immunity)，而粘膜表面的IgA提供了第一道免疫防線。sIgA是粘膜組織免疫應(yīng)答的特征，sIgA抗體可通過阻礙粘膜與細(xì)菌和病毒的接觸從而給粘膜表面提供特殊的免疫屏障。

3、胃腸道是sIgA的中樞器官。sIgA是機(jī)體內(nèi)分泌量最多的免疫球蛋白，分泌量最高可達(dá)30100 mg/(dkg)。slgA是多聚體，因此它能和病毒、細(xì)菌、寄生蟲或它們的毒素交叉連接而形成一個(gè)大分子的復(fù)合物。其結(jié)果是一方面能防止微生物的毒素等小分子的致病因子以擴(kuò)散或滲透的方式穿越粘膜屏障，另一方面則能阻止大分子的致病因子和上皮細(xì)胞的受體結(jié)合。實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗sIgA抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗sIgA抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品

4、中的sIgA呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶(凍干品)。3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120l/

5、瓶（1：100）7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120l/瓶（1：100）8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀2. 高速離心機(jī)3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時(shí)，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標(biāo)本的采集及

6、保存 1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。

7、只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。最后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為500 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml，7.8 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制250 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）500 ng/ml

8、的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10l生物素標(biāo)記抗體加990l生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10l辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990l辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液

9、 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100l，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100l（取1l生物素

10、標(biāo)記抗體加99l生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350l/每孔，甩干。 4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100l，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350l/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90l，37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順

11、序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使

12、用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。5. 建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng)1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡