影響PCR的因素

1、 影響PCR反應(yīng)的條件(1) 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。引物堿基：G+C 含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易消滅非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避開5 個(gè)以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。避開引物內(nèi)部消滅二級(jí)結(jié)構(gòu)，避開兩條引物間互補(bǔ)，特殊是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3'端的堿基，特殊是最末及倒數(shù)其次

2、個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避開因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。(2)酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的自然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高

3、可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量削減。(3)dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有親密關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其 PH調(diào)整到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是留意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低

4、。(4)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常接受SDS和蛋白酶K 來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特殊是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可接受快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般接受異硫氰酸胍或蛋白酶

5、K 法，要防止RNase降解RNA。(5)Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，消滅非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物削減。(6)溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延長(zhǎng)三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中接受三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再快速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延長(zhǎng)。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度

6、為100300bp時(shí))可接受二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延長(zhǎng)溫度可合二為一，一般接受94變性，65左右退火與延長(zhǎng)(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要緣由。一般狀況下，9394lmin足以使模板DNA變性，若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，由于高溫環(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物簡(jiǎn)單得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高

7、于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20 個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為抱負(fù)。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式掛念選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(510)在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大削減引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延長(zhǎng)溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 150 核苷酸/S/酶分子70 60 核苷酸/S/酶分子55 24 核苷酸/S

8、/酶分子高于90時(shí)， DNA 合成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延長(zhǎng)溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過(guò)高的延長(zhǎng)溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延長(zhǎng)反應(yīng)的時(shí)間，可依據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延長(zhǎng)時(shí)間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb 需延長(zhǎng)至15min。延進(jìn)步間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的消滅。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延長(zhǎng)時(shí)間要稍長(zhǎng)些。(7)循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)打算PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 影響pcr特異性的因素通過(guò)上述內(nèi)容,可以看

9、出有很多因素可以影響pcr的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以削減不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時(shí)間及延長(zhǎng)時(shí)間可以削減錯(cuò)誤引發(fā)及錯(cuò)誤延長(zhǎng)。引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以削減錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。轉(zhuǎn)變mgcl2(有時(shí)kcl)濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對(duì)taq酶的直接作用。一般認(rèn)為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48h以內(nèi)完成電泳檢測(cè)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型就會(huì)消滅不規(guī)章，甚至消逝。 Trouble shooting guide1假陰性，不消滅擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特

10、異性，酶的質(zhì)量， PCR循環(huán)條件。查找緣由亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析爭(zhēng)辯。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特殊是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不消滅擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜任憑更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否由于酶的活性丟失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需留意的是有時(shí)PCR時(shí)忘了加Taq酶或電泳時(shí)忘了加溴化乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶

11、不抱負(fù)、簡(jiǎn)潔彌散的常見緣由。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要留意引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，肯定要有引物條帶消滅，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體全都，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物使用過(guò)程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大

12、，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的轉(zhuǎn)變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增接受的體積為20l、30l、50l或100l，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是依據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20l后，再做大體積時(shí)，肯定要重新摸索條件，否則簡(jiǎn)潔失敗。物理緣由：溫度對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要。假如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能消滅假陰性；退火溫度過(guò)低，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過(guò)高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下PCR儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延長(zhǎng)溫度，這也是PC

13、R失敗的緣由之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 2假陽(yáng)性引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，簡(jiǎn)潔消滅假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種緣由：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)當(dāng)心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，全部試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使

14、用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有肯定的同源性。可相互拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消退。3消滅非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后消滅的條帶與估計(jì)的大小不全都，或大或小，或者同時(shí)消滅特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的消滅，其緣由：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次，是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易消滅非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不消滅，酶的量過(guò)多有時(shí)也會(huì)消滅非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)，重新設(shè)計(jì)引物