流式細胞術在白血病MICM分型診斷中的作用(壓縮圖片)

1、M：morphology,形態(tài)學 I： immunology,免疫學 C： cytogenetics ,細胞遺傳學M：molecular biology ,分子生物學 （molecular genetics，分子遺傳學）M：morphology,形態(tài)學（FAB分型）髓系（acute nonlymphocytic leukemia,ANLL; acute myeloid leukemia,AML） （M0 ：急性髓細胞白血病微分化型）M1 ：急性原粒細胞白血病未分化型M2 ：急性原粒細胞白血病部分分化型M3 ：急性早幼粒細胞白血病M4 ：急性粒-單核細胞白血病M5 ：急性單核細胞白血病M6 ：急

2、性紅白血病M7 ：急性巨核細胞白血病淋系（acute lymphocytic leukemia,ALL）L1 ：原幼淋巴細胞以小細胞為主L2 ：原幼淋巴細胞以大細胞為主L3 ：大細胞為主，細胞質多，深藍，蜂窩狀I： immunology,免疫學Type of cellCD markersstem cellsCD34+, CD31-all leukocyte groupsCD45+GranulocyteCD45+, CD15+, CD24+, CD114+, CD182+MonocyteCD45+, CD14+, CD114+, CD11a, CD91+T lymphocyteCD45+, CD

3、3+T helper cellCD45+, CD3+, CD4+T regulatory cellCD4, CD25, and Foxp3Cytotoxic T cellCD45+, CD3+, CD8+B lymphocyteCD45+, CD19+ or CD45+, CD20+, CD24+ThrombocyteCD45+, CD61+Natural killer cellCD16+, CD56+, CD3-, CD31, CD30C： cytogenetics，細胞遺傳學染色體核型分析（chromosome karyotyping）M：molecular biology，分子生物學 m

4、olecular genetics，分子遺傳學基因突變（gene mutations）融合基因（fusion genes）BCR-ABLTEL-AML1流式細胞術流式細胞術Flow Cytometry，FCM檢測信號及意義：檢測信號及意義：FSC/SSC 二維點圖（二維點圖（dot plot）中性粒細胞中性粒細胞單核細胞單核細胞淋巴細胞淋巴細胞閾值閾值細胞碎片細胞碎片二、數據解釋及報告二、數據解釋及報告1.定性的描述（陽性或陰性）2.評估抗原表達強度3. 區(qū)分弱陽性和陰性群體 運用流式分析造血細胞的抗原表達情況，遠遠多于對形態(tài)學結果的簡單證實，能夠提供大量的信息，可能幫助形態(tài)學確認某些診斷，也

5、可能提出之前沒有考慮的診斷；在一些典型表現下，流式免疫分型可以在其他方法的輔助之下診斷疾病。 但是，流式免疫分型結果的解釋應與臨床、形態(tài)學、細胞遺傳學等其他方法結合使用，綜合考慮，做出疾病的診斷與分類。正常血細胞發(fā)育過程的抗原表達規(guī)律正常血細胞發(fā)育過程的抗原表達規(guī)律按WHO造血和淋巴組織腫瘤分類（2008年版）Wood B,etc（2007）急性白血病的免疫表型急性白血病的免疫表型急性髓細胞白血病的免疫表型急性髓細胞白血病的免疫表型劉艷榮，等（2010）急性淋巴細胞白血病的免疫表型急性淋巴細胞白血病的免疫表型急性系列不明型白血病的免疫表型急性系列不明型白血病的免疫表型慢性淋巴細胞白血病的免疫表

6、型慢性淋巴細胞白血病的免疫表型一、一、CLLCLL的免疫表型特點的免疫表型特點二、二、FCMFCM檢測檢測CLLCLL的預后指標的預后指標1. ZAP-70 ZAP-70+ CLL預后不好。2. CD38 是CLL疾病侵襲的重要標志，CD38+ B-CLL患者預后不好。三、鑒別單克隆三、鑒別單克隆B B淋巴細胞增多癥淋巴細胞增多癥 單克隆B淋巴細胞增多癥（MBL）指健康個體外周血中存在低水平的單克隆性B淋巴細胞增多。四、鑒別診斷四、鑒別診斷 CLL是以外周血及骨髓中成熟的淋巴細胞增多為主要臨床特點的惡性疾病。除了CLL，還包括其他多種生物學上完全不同的成熟B淋巴細胞腫瘤。正確鑒別將有助于預后評

7、估和治療方案的選擇。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則一、常用抗體一、常用抗體 白細胞分化抗原（leukocyte differentiation antigen）是指血細胞在分化成熟為不同譜系、不同階段及細胞活化過程中，出現或消失的細胞表面標記分子。 1982年，國際統一使用分化群（cluster of differentiation，CD）作為白細胞分化抗原和相應單克隆抗體的命名，CD分子在流式細胞術的血液學應用中發(fā)揮著重要作用。CD1a 表達于皮質胸腺細胞、樹突狀細胞和Langerhans細胞，主要用于T淋巴細胞白血病及淋巴瘤的免疫分型。表達CD1a的T-ALL為皮質型。CD2

8、 泛T細胞標志，表達于T淋巴細胞、胸腺細胞和大多數NK細胞上。急性T淋巴細胞白血?。╝cute T lymphoblastic leukemia，T-ALL）、成熟T細胞增生異常性疾病、急性雙表型白血病、原始NK細胞淋巴瘤/白血病、肥大細胞白血病及少部分急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML），尤其是變異性急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）中有CD2表達。CD3 表達于T淋巴細胞、胸腺細胞和NK細胞。是T細胞增值性疾病中最特異的標志，在成熟和部分初始T細胞中均有表達。胞漿CD3（cCD3）在初始T細胞（前胸腺

9、細胞）上表達，胸腺細胞表達胞漿和（或）膜表面CD3（mCD3）。前體T細胞腫瘤通常不表達mCD3，但cCD3為陽性。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則CD4 表達于輔助性T淋巴細胞、外周血單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。大多數外周血T細胞淋巴瘤、部分AML、慢性粒單核細胞白血病（acute myelomonocytic leukemia，CMML）、急性單核細胞白血?。ˋML-M4/M5）、APL和組織細胞腫瘤中伴有CD4表達。少部分T-ALL中有CD4限制性表達，大多數T-ALL同時表達CD4、CD8或者兩者同時為陰性。CD5 主要表達于胸腺細胞、成熟T淋巴細胞和B淋巴細胞亞型。作

10、為一個泛T細胞抗原，CD5可表達于成熟或不成熟T細胞增值性疾病中，包括T-ALL。在腫瘤性T細胞發(fā)育過程中，CD5容易丟失。正常人外周血和淋巴組織中存在CD5+B細胞，兒童及年輕患者更多見。CD5主要表達于慢性淋巴細胞白血?。˙-cell chronic lymphocytic leukemia，B-CLL）、小淋巴細胞淋巴瘤（small cell lymphocyte lymphoma，SLL）和套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）。少部分彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）表達CD5，而且原發(fā)性CD5+DL

11、BCL預后較CD5-DLBCL更差。CD7 主要表達于T淋巴細胞、NK細胞和多能干細胞。在T細胞發(fā)育過程中，CD7是最早出現的T細胞標志，且貫穿表達于整個T細胞分化發(fā)育過程中。在外周T細胞異常性疾病中，CD7通常表達異常、減弱或消失。T-ALL中CD7陰性表達者僅占2%。此外，CD7還可表達于原始NK細胞淋巴瘤/白血病和AML，而APL和B系淋巴增值性疾病中，CD7表達多為陰性。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則CD8 表達于殺傷性或抑制性T淋巴細胞、胸腺細胞和某些NK細胞上。大部分大顆粒T淋巴細胞白血病（T-large granular lymphocyte leukemia，T-

12、LGL）和腸型淋巴瘤、少部分外周T細胞增值性疾病表達CD8。極少T-ALL表達CD8，而CD4陰性。CD9 表達于單核細胞、前B細胞亞群、激活的T細胞、嗜酸與嗜堿性粒細胞、血小板，主要用于急性白血病免疫分型及微量殘留病的檢測。CD10 又名急性淋巴細胞白血病共同抗原（common acute lymphoblastic leukemia antigen，CALLA），表達于前B、前T淋巴細胞、生發(fā)中心B細胞和成熟粒細胞絕大多數急性B淋巴細胞白血病（B-ALL）、少數T-ALL、多數濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）、部分DLBCL和Burkitt淋巴瘤、少數AML-M

13、5中有CD10表達。成熟粒細胞缺乏CD10的表達常常與骨髓增生異常綜合征（myelodysplasia，MDS）相關。在FL和DLBCL中，CD10+者預后更好。CD11b 表達在單核細胞、粒細胞和部分NK細胞上，成熟B和T細胞不表達。部分急性髓細胞白血病表達CD11b，常代表單核細胞的分化，AML-M0、M1和M2很少表達。APL通常也是CD11b陰性。常用CD11b觀察MDS中單核和粒細胞的發(fā)育分化。CD11c 單核細胞和組織巨噬細胞中強表達，粒細胞中表達強度較低，正常激活的CD8+細胞也可表達。CD11c強表達式毛細胞白血病（hairy cell leukemia，HCL）和AML-M5

14、的典型特征。其他惡性血液病，包括B-CLL，邊緣帶B細胞淋巴瘤（marginal zone B-cell lymphoma，MZL）、除APL外的其他AML也有CD11c的弱表達。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則CD13 表達于粒細胞、單核細胞及其前體細胞上。CD13數全粒細胞分子，不同發(fā)育階段的所有粒系細胞均有表達。大多數AML和5%15%ALL可表達CD13。CD14 是成熟單核細胞的最好標志，大多數CMML和AML-M4中的單核細胞強表達CD14；AML-M5中，原單和幼單細胞通常為CD14陰性或弱表達。正常粒細胞CD14陰性，但慢性增值性疾病，如CML或真性紅細胞增多癥（p

15、olycythemia vera，PV）中的粒細胞部分有CD14的表達上調。CD15 除原粒細胞外的所有粒細胞、多數單核細胞、少數巨核細胞和組織細胞表達CD15。CML、部分AML和大多數經典型霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）表達CD15。CD16 表達于正常的粒細胞、NK細胞和大顆粒T細胞上。T-LGL、NK細胞增生、肝脾T細胞淋巴瘤和部分單核系腫瘤中常表達CD16，而原粒細胞和典型APL細胞中CD16陰性。粒細胞發(fā)育異常時?？梢奀D16表達下調。CD19 表達于B系細胞核濾泡狀樹突細胞上，成熟和不成熟B系腫瘤中均表達CD19，良性漿細胞、少數惡性漿細胞也可見CD19的

16、表達，部分AML表達CD19，常與t（8；21）相關。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則CD20 表達前B細胞晚期和成熟B細胞上，但前體細胞和終末漿細胞不表達。CD20出現在免疫球蛋白（Ig）輕鏈基因重排和表面Ig表達之間的B細胞表面。多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）表達CD20者預后不好。CD22 為泛B細胞標志，其表達與CD22抗體所標記的熒光素有直接關系。利用CD22-PE抗體，可以發(fā)現CD22表達于B細胞分化的早期，在成熟期表達強度增加。而利用CD22-FITC抗體，只能發(fā)現在成熟的B細胞表面CD22陽性，此時表面CD22可與表面IgM和（或）IgD同時

17、或提前表達。絕大多數TdT+前體B細胞呈胞漿CD22陽性；多數淋巴細胞惡性腫瘤、特別是HCL、脾MZL和幼淋巴細胞白血病（prolymphocytic leukemia，PLL）強表達CD22，而B-CLL中CD22表達較弱。CD23 表達在正常成熟B細胞上，大多數B-CLL/SLL強表達。CD5+CD23+是B-CLL/SLL的典型特征，而MCL為CD5+CD23-，少部分MCL表達CD23，但表達較弱。部分FL和DLBCL、少數AML-M5和CMML中表達CD23.CD25 表達于激活的T、B細胞，主要表達于HCL、成人T細胞白血病/淋巴瘤（adult T-cell leukemia/ly

18、mphoma，ATCL）和少數其他T、B細胞增殖異常的疾病中。變異性HCL不表達CD25，對經典的HCL治療不敏感，生存期短。CD30 主要表達于激活的T、B淋巴細胞和單核細胞。經典型HL和間變大細胞淋巴瘤（anaplasic large cell lymphoma，ALCL）可伴有CD30強表達，部分B系淋巴瘤又有CD30的表達。HL患者胞漿CD30水平增高時預后不良標志。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則CD33 表達髓系前體細胞、粒細胞和單核細胞，正常人的CD33的表達強度有變異。各AML亞型均有CD33的表達，10%20%的ALL也可伴CD33表達。CD34 表達于早期造血干

19、/祖細胞，是髓系早期細胞和TdT+不成熟淋巴細胞的表面標志。大多數ALM和前體B/T淋巴細胞白血病表達CD34，粗顆粒型APL通常不表達，而細顆粒型APL往往伴有CD34部分表達。CD36 表達于單核細胞、紅細胞、巨核細胞和血小板，與CD64聯合分析單核細胞的分化比CD14更敏感。CD38 表達于前體B細胞、終末分化的漿細胞、髓系祖細胞、粒細胞和單核細胞和紅系前體細胞。成熟B細胞CD38的表達減弱或消失。除漿細胞中強表達CD38外，絕大多數AML和B-ALL表達CD38，強度較漿細胞弱。CD38+B-CLL患者預后不好。CD41a和CD42b 表達與巨核細胞和血小板，常用于AML-M7的免疫分

20、型診斷，但有時會出現于其他細胞，例如單核細胞的非特異性結合。CD45 有名白細胞共同抗原（leukocyte common antigen，LCA），表達于所有造血細胞（不包括成熟紅細胞和血小板）及造血細胞的個分化亞群上。在白細胞成熟過程中，CD45的表達有區(qū)別，原始細胞表達較低，成熟髓細胞中度表達，單核細胞和淋巴細胞表達最高。CD45陰性表達的常見腫瘤包括：MM、M6，部分B-ALL和髓外腫瘤。成熟B細胞腫瘤可能伴有CD45表達減弱。有些MM弱表達CD45，與骨髓瘤細胞的增殖率有關。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則CD45RA和CD45RO 表達于B和T細胞亞群，前者主要表達在初

21、始細胞，后者大部分表達在記憶性T細胞上。CD52 表達于所有正常T細胞、多數惡性T細胞和成熟B細胞增值性疾病中。目前免疫分型檢測的主要目的是用于抗CD52的單抗治療。CD56 表達NK細胞、部分T細胞和單核細胞，少數增生期的髓細胞也可弱表達。NK細胞白血病、部分MM、AML中常伴CD56的陽性表達。CD19和CD56共表達與伴有t（8；21）的AML相關。在伴有t（8；21）或t（15；17）的AML中，CD56的陽性表達是預后不好的因素。CD58 表達于所有造血和非造血細胞，前體細胞表達較強，成熟細胞表達強度減弱。CD58主要用于區(qū)分ALL和良性前體B細胞，可用于ALL和MRD檢測。CD61

22、 表達與巨核細胞和血小板，常用于AML-M7的免疫分型診斷，但有時會出現于其他細胞，例如單核細胞的非特異性結合。與CD42b聯合應用可以區(qū)分血小板和原始細胞。CD64 表達于單核細胞和中性粒細胞上，主要用于分析單核細胞的分化。CD64可表達于AML-M4/M5和CMML中的單核細胞，大多數其他類型AML中的原始細胞也表達CD64，但較單核細胞表達弱。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則CD71 一種轉鐵蛋白受體，通常在增殖活躍的造血細胞上表達，紅系前體細胞表達較強，和可以表達與髓系、激活的淋巴增殖細胞上。可鑒別不成熟的紅細胞，主要用于M6和MDS的診斷。CD103 表達于B淋巴細胞亞群

23、和粘膜固有層T淋巴細胞，在HCL中強表達。腸型T細胞淋巴瘤和MZL也可表達CD103。CD117 表達于造血祖細胞、不成熟的粒細胞和肥大細胞。大多數AML中的原始細胞均有CD117表達，多數M5可見CD117陰性。另外，肥大細胞增生、MM、部分T-ALL和少數CD8+成熟T淋巴細胞增殖性鑒別均可見CD117陽性表達。CD123 表達于骨髓干/祖細胞、單核細胞、粒細胞、嗜堿性粒細胞和巨核細胞。漿樣樹突狀細胞和嗜堿性粒細胞中強表達。多數AML和B-ALL常伴有CD123高表達。CD138 主要表達于漿細胞，用于MM的免疫分型和殘留骨髓瘤細胞的檢測。CD200 表達于胸腺細胞、B細胞、脾濾泡樹突狀細

24、胞和部分T細胞亞群上。有助于鑒別CLL和MCL，CLL常為CD200+，而MCL往往為CD200-。CD235a 又名GlyA表達于人紅細胞、紅系前體細胞上，主要用于識別紅細胞。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則Bcl-2 表達于T細胞和部分B細胞上，正常生發(fā)中心細胞Bcl-2的表達為陰性。主要用于鑒別CD10+的FL和Burkitt淋巴瘤，FL常表達Bcl-2，而Burkitt淋巴瘤為Bcl-2的表達為陰性。cIgM（c） 前B細胞表達的第一個免疫球蛋白重鏈，表達于部分漿細胞和成熟B細胞。常用于判斷B-ALL的分期。cyclinD1 細胞周期蛋白，多種腫瘤中高表達，可作為評價預后的

25、指標，造血系統腫瘤中主要應用于CML的診斷。FMC7 表達于成熟B淋巴細胞亞群，主要用于鑒別B-CLL和其他B系增殖性腫瘤，B-CLL中FMC7表達為陰性。HLA-DR 表達于各階段的B淋巴細胞（大部分漿細胞除外）、造血祖細胞、髓系、紅系和巨核系前體細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、不成熟的T細胞及活化T細胞上。原始粒細胞表達HLD-DR，細胞成熟至早幼粒細胞時HLA-DR消失。絕大多數B-ALL和AML表達HLD-DR，但APL、MM和大部分T細胞白血病/淋巴瘤一般不表達。Ig和Ig 表達于正常B淋巴細胞，B系淋巴瘤中常見胞膜免疫球蛋白輕鏈的限制性表達，MM中常見胞漿免疫球蛋白輕鏈的限制性表達

26、。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則MPO 髓過氧化物酶，表達于粒細胞的嗜苯胺藍顆粒中，在循環(huán)單核細胞中低密度存在。某些AML的原始細胞也有表達，MPO用于髓系白血病及髓系分化的鑒別。TCR TCR分子是有/或/鏈組成的異二聚體，可與CD3復合物同時表達。多數胸腺細胞和成熟T細胞表達TCR / 異二聚體，不足5%的胸腺細胞和成熟T細胞表達TCR / 。主要用于成熟T淋巴系統腫瘤的分類。TdT 末端脫氧核酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）存在于正常胸腺和骨髓中未成熟T、B細胞的胞核中。大多數T-ALL和B-ALL、部分AML（

27、AML-M0更多見）和少數淋巴瘤表達TdT。TCR V T細胞受體的鏈變異區(qū)，用于鑒別T細胞的克隆性，主要應用于成熟T細胞增殖性腫瘤的免疫分型診斷中。ZAP-70 表達于T細胞、NK細胞核前B細胞上，主要用于CLL/SLL的免疫分型。細胞內ZAP-70的表達與IgVH基因突變狀態(tài)有關，ZAP-70+CLL預后不好。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則二、白血病免疫分型抗體組合原則二、白血病免疫分型抗體組合原則（一）國際指南中抗體使用原則（一）國際指南中抗體使用原則 國際“臨床和實驗室標準化協會”血液淋巴系統腫瘤細胞的臨床流式分析指南（第二版，

28、2007）指出：免疫分型的一個基本原則是腫瘤性血液淋巴細胞表達正常細胞特定系列和特定成熟期的表面和細胞內抗原，這些抗原可被適當的抗體檢測。 較理想的組合是，實際的數量足夠識別異常細胞和標本中存在的所有正常細胞。當對一個已經診斷的病例檢測以證實、分類、監(jiān)測及分期時可使用較少的抗體。在設計組合是有兩種方法：一步法一步法，使用足夠的試劑一次性完成惡性細胞和正常細胞的定性；兩步法兩步法，開始使用較少的抗體，然后根據第一步的結果選擇其他的抗體。 總體來講，使用試劑越多，對異常細胞的檢測和定性的敏感性和特異性越高?；谟杏玫呐R床和形態(tài)信息，可采用“靶點”方法選用少數抗體。雖然這種方法可以減少成本，但萬一提

29、供的臨床信息是錯誤的或缺乏的，則具有一定的風險。根據國際上的一致意見，需要大量的試劑來完成慢性淋巴增殖性疾病、組織淋巴瘤、急性白血病和其他血液學腫瘤的免疫分型。 指南參與者認為，至少需要20個抗體來完成急性白血病的定性，對慢性淋巴細胞增殖性疾病需要相似的抗體數。另外，定的表面和細胞內抗體最近被證明具有診斷和預后意義。隨著臨床有關新抗體的認識，原本較大的分類抗體數開可能要增加。免疫分型的抗體組合原則免疫分型的抗體組合原則（二）國際流式細胞專家的共識（二）國際流式細胞專家的共識 2006年，國際流式專家在Bethesda對診斷血液淋巴系統腫瘤所需要的試劑進行了討論達成一定共識。免疫分型的抗體組合原

30、則免疫分型的抗體組合原則（三）國內流式細胞專家使用原則（三）國內流式細胞專家使用原則（北京大學血液病研究所）（北京大學血液病研究所）急性白血病亞型分型和急性白血病亞型分型和MRD檢測時使用的主要抗體：檢測時使用的主要抗體：1. 急性白血病的診斷和分型抗體 B-ALL：CD19、 CD10、 CD34、 TdT、 CD20、 CD22、 CD79a、 skappa、 slambda、c T-ALL：CD2、 m/cCD3、 CD4、 CD5、 CD7、 CD8、 CD1a、 TdT、 CD34 AML：CD34、 CD117、 CD38、 HLA-DR - 干/祖細胞CD15、CD11b、CD13、C