發(fā)酵設計大全

1、年產17噸青霉素發(fā)酵車間工藝設計第一部分 青霉素的發(fā)酵工藝1菌種最早發(fā)現(xiàn)產生青霉素的原始菌種得英國科學家茀萊明分離的點青霉，合成能力低下，沉沒培養(yǎng)時只能產生2U/mL，遠遠不能滿足工業(yè)生產的要求。后來找到另一種生產能力較強且適合液體深層培養(yǎng)的產黃青霉菌種，并再經(jīng)X射線、紫外線誘變處理，得到生產能力較高的菌種，生產能力可達1000一1500U/mL。顧名思義，產黃青霉容易產生大量的黃色素，且分離時不易除去，故再將此菌進一步誘變處理，使其產生黃色素的能力喪失后，才成為世界通用的生產菌種?，F(xiàn)代分子生物學方法的發(fā)展，為青霉素菌種的改進提供了新的契機，結合基因工程技術和發(fā)酵工藝的改進，使當今世界青霉素工

2、業(yè)發(fā)酵水平已達85000U/mL以上。國內大多數(shù)生產廠都采用綠孢子絲狀菌。細胞生長發(fā)育分為6期：長菌絲為主；合成產物為主；放罐。青霉素生產中，菌種是活的靈魂，對菌種的保藏至關重要。國內生產廠家一般在真空干燥狀態(tài)下保存其分生孢子。也可用甘油或乳糖溶液作懸浮劑，在一70冰箱或液氮中保存孢子懸浮液或營養(yǎng)菌絲體。由于分生孢子在保存過程中較營養(yǎng)菌絲體更易變異，故保存營養(yǎng)菌絲是青霉素生產菌種保存的首選。2青霉素發(fā)酵工藝流程、工藝要點及過程控制（1）絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程 冷凍管（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）斜面母瓶（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）大米孢子（26°C，種子培養(yǎng)56h,

3、1:1.5vvm）一級種子培養(yǎng)液（27°C，種子培養(yǎng)，24h,1:1.5vvm）二級種子培養(yǎng)液（2726°C,發(fā)酵,7天,1:0.95vvm）發(fā)酵液。 種子制備階段包括孢子培養(yǎng)和種子培養(yǎng)兩個階段。孢子培養(yǎng)以獲得豐富的孢子(斜面孢子和米孢子)為目的；種子培養(yǎng)以獲得大量健壯的營養(yǎng)菌絲體(種子罐培養(yǎng))為目的。孢子和種子質量對青霉素的產量有直接影響，必須對其生產過程的每一環(huán)節(jié)嚴格控制。(2) 工藝要點a 生產孢子的制備 斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖和蛋白胨。孢子培養(yǎng)基：大米或小米固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件是在無菌條件下25培養(yǎng)7天。成熟的孢子進行真空干燥后，低溫保存?zhèn)溆?。b 生產種子的制

4、備 青霉素生產種子常用二級種子罐培養(yǎng)。第一級種子罐接入孢子，接種量為每立方米培養(yǎng)基不少于200億孢子。培養(yǎng)基組成為玉米漿、乳糖和葡萄糖等。培養(yǎng)條件為27±1培養(yǎng)40h 圖22 青霉素生產一般流程圖左右，控制通氣量為1：3m3/(m3?min)，攪拌轉速為300350r/min。一級種子培養(yǎng)溫度高于青霉菌的生長和生產溫度，主要是為了促進孢子的萌發(fā)。 二級種子培養(yǎng)時接入10%一級種子，以葡萄糖和玉米漿等為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25±1，培養(yǎng)時間1014h，通風比(1：1)(1：5) m3/(m3?min)，攪拌轉速為250280r/min。種子質量要求：菌絲稠密，菌絲結團很少，菌絲粗

5、壯，有中小空胞。在最適生長條件下，達到對數(shù)生長期時菌絲體量的培增時間約為67h。菌種保存時間過長、上一級種子生長不良、原材料質量發(fā)生波動等，都將影響菌體生長速度，使倍增時間延長。在工業(yè)生產中，培養(yǎng)條件及原材料質量均應嚴格控制，以保持種子質量的穩(wěn)定性。c 發(fā)酵生產 發(fā)酵以葡萄糖、花生餅粉、麩質水、尿素、硝酸銨、硫代硫酸鈉、苯乙酰胺和碳酸鈣為培養(yǎng)基。發(fā)酵階段的工藝要求見表2一1。 對于分批發(fā)酵來說，這一過程又分為菌體生長和產物合成兩個階段。前一階段菌絲體快速大量生長。由生長階段轉入產物合成階段的必要條件是菌絲體的比生長速率降低到一個合適的水平，這可通過降低葡萄糖濃度的方法來間接控制。為了維持青霉素

6、的持續(xù)合成能力，在合成階段，需要維持菌絲體處于最低比生長速率。在轉入合成階段時，菌絲濃度不宜過高，以確保生產期菌絲體濃度有繼續(xù)增加的余地。發(fā)酵時的接種量約為20%，發(fā)酵溫度先期為26后期為24，通氣量為1：(0.81.2) m3/(m3?min)，攪拌速度為150200r/min。表2一1 青霉素發(fā)酵的一般工藝要求標準狀態(tài)下的空氣流量。發(fā)酵過程必須適當加糖，并補充氮、硫和前體。加糖時要控制好殘?zhí)橇?，前期和中期約控制在0.30.6%范圍內，加入量主要決定于耗糖速度、pH值變化、菌絲量及培養(yǎng)液體積。pH值控制：一般，前期60h內維持pH值6.87.2，以后穩(wěn)定在6.5左右。部分菌種，例如產黃青霉綠

7、色孢子，最適pH值則始終在6.46.5范圍內，高于7.0或低于6.0則出現(xiàn)代謝異常，青霉素產量顯著下降。泡沫控制：前期泡沫主要是花生餅粉和麩質水引起的，在前期泡沫多的情況下，菌絲體需氧量也低，可通過間歇攪拌來控制；中期泡沫可通過加油(消泡劑)來控制，必要時可略為降低通氣量，但攪拌必須開足，否則會影響菌體呼吸。發(fā)酵后期產泡沫的量一般很少，勿需特殊控制。發(fā)酵時間應從三個方面考慮：累計產率(發(fā)酵累計總億產量與發(fā)酵罐容積及發(fā)酵時間之比值)最高；單產成本(發(fā)酵過程的累計成本投入與累計總億產量之比值)最低；發(fā)酵液質量最好(抗生素濃度高，降解產物少，殘留基質少，菌絲自溶少)。這三個方面在發(fā)酵過程中的變化往往

8、不同，須根據(jù)生產全局綜合考慮，進行適當折中。（3）過程控制影響青霉素發(fā)酵產率的因素包括溫度、pH值、基質濃度、溶氧飽和度、菌絲濃度、菌絲生長速度、菌絲形態(tài)等等。在發(fā)酵過程中，要對這些因素嚴格控制在適當?shù)姆秶鷥?，才能獲得理想的發(fā)酵產率。a 碳源控制 生產用青霉菌能夠利用的碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等，但各碳源對青霉素產量的影響不同，其中乳糖是合成青霉素最好的碳源，葡萄糖次之。在生產過程中，利用乳糖的成本較高，只能用退而求其次，選用葡萄糖，但必須嚴格控制其濃度。乳糖之所以是青霉素合成最好的碳源，主要是由于菌體進行乳糖的代謝速度與菌體的合成速度相適應，不會產生中間代謝

9、產物的積累。葡萄糖則不同，由于屬于快速利用的碳源，其代謝速度要比菌體的合成速度快，導致部分中間產物的積累，從而抑制青霉素合成酶的合成。在中前期，葡萄糖的最適濃度是0.30.6%，超過此范圍，將嚴重抑制青霉素合成酶的合成，從而導致青霉素合成能力的下降。低于此范圍，由于菌體營養(yǎng)不足，呼吸受阻，使菌體過早衰老甚至自溶，同樣會導致青霉素產量的下降。目前，葡萄糖的在線檢測還存在一定困難，必須取樣后用廉-愛農法滴定分析。葡萄糖的控制不是根據(jù)其濃度進行控制的，而是根據(jù)pH值、溶氧或CO2釋放率予以調節(jié)。b 前體控制 前體主要是指用來合成青霉素分子上含苯環(huán)基團的側鏈的苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等。青霉菌即

10、可將前體直接結合到青霉素分子中，也可作為養(yǎng)料和能源利用，即氧化為二氧化碳和水。前體究竟通過哪個途徑利用，主要取決于培養(yǎng)條件以及所用菌種的特性。早期采用的Q176菌株，將大部分前體(71%94%)氧化消耗掉，只有2%10%轉化為青霉素。而現(xiàn)代工業(yè)生產所用的菌種，前體轉化率為46%90%，為了避免前體加入濃度過大而對菌體產生不利影響，除基礎料中加入0.07%外，其余按需要同氮源一起補入。前體對青霉菌的生長發(fā)育有毒性，其毒性大小取決于培養(yǎng)基的pH值和前體的濃度。苯乙酰胺在堿性時毒性較大，pH=8時即抑制菌體的生長；苯乙酸在酸性(pH5.5)時毒性較大，堿性時不抑制菌絲體生長；pH在中性時苯乙酰胺的毒

11、性大于苯乙酸。前體用量大于0.1%時(除苯氧乙酸外)，青霉素的生物合成均會下降，尤以苯乙酰胺更甚。一般認為發(fā)酵液中發(fā)酵液中前體的濃度始終維持在0.1%為宜。前體的氧化速度除與培養(yǎng)基的pH有關外，也與菌齡有關，苯乙酸被菌體氧化的速率，隨培養(yǎng)基pH上升而增加。年輕的菌絲不氧化前體，而僅利用它來構成青霉素分子。隨著菌齡的增大，氧化能力漸漸增強。培養(yǎng)基成分對前體的氧化程度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復合培養(yǎng)基對前體的氧化量少。這可由前體氧化的中間產物，即鄰羥基苯乙酸，在培養(yǎng)基中的積累得到說明。搖瓶實驗發(fā)現(xiàn)，在通氣條件差的情況下，菌體氧化前體的能力顯著降低。另外，將培養(yǎng)在含葡萄糖或乳糖培養(yǎng)基上的菌絲與不含糖

12、的培養(yǎng)基上的菌絲轉移到緩沖液(三天菌齡)中，對青霉菌氧化前體的能力進行測試比較，發(fā)現(xiàn)前者比后者減弱一半。為了盡量減少苯乙酸的氧化，生產上多用間歇或連續(xù)添加低濃度苯乙酸的辦法，以保持前體的供應速率僅略大于生物合成的需要。也有人研究用蔗糖和苯乙酸鈉鹽壓成的片劑來給青霉素搖瓶發(fā)酵進行間歇補料，這種片劑的內含物在溶液中緩慢釋放，可控制其釋放時間和速度。采用這一方法進行的搖瓶試驗，發(fā)酵9天后發(fā)酵液中青霉素的效價達16150u/mL，而對照組的效價僅6700u/mL。 pH的影響及控制：青霉素發(fā)酵的最適pH，一般認為是6.56.9，應盡量避免超過7.0，因為青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，容易加速消解。在緩沖能

13、力較弱的培養(yǎng)基中，pH變化是葡萄糖流加速度高低的指征。但在緩沖能力較強的培養(yǎng)基中，這種控制應pH反應不靈敏而不十分可靠。在青霉素發(fā)酵中pH是通過下列手段控制的：如pH過高，可添加糖、硫酸或銨鹽；pH較低可加入CaCO3、NaOH、氨或尿素，也可提高通氣量。也有利用自動加入酸或堿的方法，使發(fā)酵液pH維持在最適范圍，以提高青霉素產量。用補糖來控制pH比用酸、堿來調節(jié)好。一種是恒速補糖，用酸或堿來控制pH；另一種是根據(jù)pH來補糖，即pH上升得快就多補，pH下降時少補或不補，以維持pH6.56.9范圍。實踐發(fā)現(xiàn)，后一種方法對提高青霉素產量更為有利，既能滿足青霉菌在不同階段對糖的需要，又能控制pH在最適

14、范圍內。前一種方法雖然也能控制pH，但滿足不了菌體代謝和合成青霉素的需要，可能導致菌體的代謝向不利于青霉素合成的方向變化。 溫度的影響及控制： 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株不同可能稍有差異。對菌絲生長和青霉素合成來說，所要求的最適溫度是不一樣的。一般生產的適宜溫度為27，而分泌青霉素的最適溫度在20左右。在青霉素合成期，如溫度過高，明顯降低發(fā)酵產率，同時增加葡萄糖的維持消耗，降低葡萄糖至青霉素的轉化得率。生產上采用變溫控制法，使適合不同發(fā)酵階段的溫度需要。如采用從26是逐漸降低至22，可延緩菌絲體衰老，延長發(fā)酵周期，增加培養(yǎng)基中的溶氧，提高青霉素產量。e 溶氧控制 溶氧是影響青霉素產量的重要

15、因素。一般要求溶氧飽和度高于30%，如過低，青霉素產率急劇下降；若低于10%，將造成不可逆的損失。發(fā)酵液中溶氧過高，說明菌絲生長不良或營養(yǎng)不足，同樣會導致生產能力下降。f 其它營養(yǎng)成分控制 氮源也是青霉素發(fā)酵的關鍵。開始時，培養(yǎng)基中的銨濃度要達到35g/L為宜。一般在基礎料中加入0.05%的尿素，而后在補糖時，再逐漸補充部分尿素，有利于提高青霉素產量。另外，在發(fā)酵液中加少量聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉等可溶性高分子化合物，可以防止菌絲體因攪拌被打斷，也可防止菌絲體結團，從而可使青霉素的產量增加38%。g 鐵離子控制 發(fā)酵液中的三價鐵離子濃度對青霉素合成有顯著影響。當三份鐵離子濃度超過3040g/mL時

16、，青霉素合成速度明顯減緩。要控制鐵離子濃度，除了注意培養(yǎng)基配比和水質外，還要防止鐵質容器內壁上的可溶性鐵離子溶解到發(fā)酵液中來。一般要將鐵質容器壁涂以環(huán)氧樹脂等保護層。（5）菌絲濃度 發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度, 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達到平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強度 (取決于維持因數(shù)的大小, 維持因數(shù)越大,呼吸強度越高) 、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學性質而異。呼吸強度低的菌株降低發(fā)酵中氧的消耗速率，而通氣與攪拌能力強的發(fā)酵罐及黏低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升, 從而提高臨界菌體濃度。（6）菌絲生長速度 用恒化器進行的發(fā)酵試驗證明

17、，在葡萄糖限制生長的條件下，青霉素比生產速率與產生菌菌絲的比生長速率之間呈一定關系。當比生長速率低于0.015h-1時，比生產速率與比生長速率成正比, 當比生長速率高于 O. 015h-1時, 比生產速率與比生長速率無關 D 因此, 要在發(fā)酵過程中達到并維持最大比生產速率, 必須使比生長速率不低0.015h-1 。這一比生長速率稱為 臨界比生長速率。對于分批補料發(fā)酵的生產階段來說, 維持0.015h斗的臨界比生長速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍, 這在實際工業(yè)生產中是很難實現(xiàn)的。事實上 , 青霉素工業(yè)發(fā)酵生產階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多, 卻仍然能達到很高的

18、比生產速率。這是由于工業(yè)上采用的補料分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶, 抵消了一部分生長, 故雖然表觀比生長速率低, 但真比生長速率卻要高一些。（7）菌絲形態(tài) 在長期的菌株改良中 , 青霉素產生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長和結球生長兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質及氧接觸, 故一般比生產速率較高； 后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低, 使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高, 從而允許更多的菌絲生長 (即臨界菌體濃度較高), 發(fā)酵罐體積產率甚至高于前者。在絲狀菌發(fā)酵中, 控制菌絲形態(tài)使其保持適當?shù)姆种Ш烷L度, 并避免結球 , 是獲得高產的關鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中, 使菌絲球保持適當大小和松緊 , 并盡量減少游離菌絲的含量, 也是充分發(fā)揮其生產能力的關鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強度及比生長速率密切相關。g. 發(fā)酵液質量控制 生產上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣 , 用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產上慣稱" 鏡檢 ",根據(jù)" 鏡檢 "中菌