抗菌肽生產關鍵技術及其產業(yè)化改

1、抗菌肽生產關鍵技術及其產業(yè)化吳松剛 施巧琴 鄭 毅 黃建忠（福建師范大學工業(yè)微生物發(fā)酵技術國家工程研究中心 福州 350108）趙燕玉 蔡玉鳳 孫 艷 黃欽耿 （福建省麥丹生物集團有限公司福州研究院 福州 350107）1.0 技術背景抗菌肽具有多種功效，可替代對人類健康有危害的抗生素和抗菌類藥物在飼料中添加，是理想的無毒、無殘留、高效廣譜、抗菌，促生長的綠色飼料添加劑，被認為是抗生素的理想替代品。目前我國采用高效抗菌肽生產菌株，使用優(yōu)化發(fā)酵工藝，配合低溫干燥技術，生產具有高效價的抗菌肽產品。隨著社會的發(fā)展和人們的生活水平提高，更多的人越來越關心食物的安全和健康問題，無污染、無殘留和無公害的安

2、全綠色食品已逐步成為人們一種新的消費追求。飼料添加劑是生產飼料的源頭之一，其質量直接影響飼料的質量，而飼料的質量又直接影響到畜禽的質量，所以要生產出綠色安全的畜禽產品，就必須嚴把飼料添加劑的質量和安全關。目前，所有的常規(guī)抗生素都出現了相應的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經日益嚴重地威脅著人們的健康。隨著抗生素的大量廣泛用于飼料中和人們對食品和環(huán)境質量的要求越來越高，人們對抗生素的副作用認識日益加深，抗生素在飼料業(yè)中的應用，已面臨著淘汰或禁用的局面。從2006年4月1日開始，歐盟已禁止在飼料中添加抗生素類飼料添加劑。許多國家對抗生素、化學合成藥品的使用、淘汰、畜產品中的藥物殘留作了非常嚴格

3、的限定，并致力于開發(fā)和推廣無害的綠色飼料添加劑，以生產出安全可靠的食品“綠色畜產品”，來滿足人們的需求。人們正從天然物質中尋找理想的無毒、無殘留、高效廣譜、抗菌促生長的綠色飼料添加劑，并應用于養(yǎng)殖生產。我國也已經開始限制抗生素在飼料中的添加和用量，應用無毒無公害的新型抗菌劑代替抗生素作飼料添加劑，已成為當前國內外飼料學科的一項重要內容。隨著我國進入WTO，抗生素作飼料添加劑必將嚴重影響畜產品在國際市場的競爭力，借助生物高科技的最新成果，研發(fā)對環(huán)境友好型的、綠色環(huán)保的多肽類生物添加劑及抗生素替代劑，徹底扭轉和杜絕濫用抗菌素和激素類添加物的問題，是提高人類健康水平、促進生產和生活質量需要迫切解決的

4、課題?？咕? Antibacterial peptide) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide) 、抗生素肽(Antibiotics peptide) ?？咕氖巧锛毎囟ɑ蚓幋a產生的一類小分子多肽, 其生成和釋放是機體炎癥反應的組成部分, 是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。抗菌肽具有分子量低、水溶性好、熱穩(wěn)定、強堿性和廣譜抗菌等特點, 愈來愈受到重視, 研究已深入到分子結構和作用機制等多個方面。抗菌肽最初是Boman 從天蠶的免疫血淋巴中純化, 而后又在哺乳動物、鳥類、植物以及細菌中發(fā)現。時至今日, 發(fā)現的抗菌肽大約有800 多種。微生物來源的抗菌肽是抗菌

5、肽家族中的重要一員, 它能特異性殺死競爭菌而對宿主本身無害,包括環(huán)形肽、糖肽和脂肽, 如短桿菌肽、桿菌肽、多黏菌素和乳酸鏈球菌肽等。如Lantibiotic 是革蘭陽性菌產生的抗菌肽, 乳鏈菌肽nisin 是其中研究最為清楚的lantibiotic 類抗菌肽。一些由真菌產生的抗菌肽, 如哌珀霉素類( peptaibol) 抗菌肽, 主要由木霉屬土壤真菌產生。隨著人類對抗菌肽研究的進一步深入, 近年,不斷從微生物中發(fā)現和提取具有抗菌活性的肽類物質。我國抗菌肽生產菌株普遍采用枯草芽孢桿菌，其產生的是一種混合多肽, 由于結構上很相似,各個成分極難分開。已報道的桿菌肽組分有A, A' ,B,

6、C, D, E, F, F1, F2, F3, G 等。A 組分是其中生物活性最高也是最重要的組分, 通常稱之為桿菌肽Gramicidina, 分子式為C66H103N17O16S, 其結構是由12個氨基酸組成的多肽。具有環(huán)狀結構, 分子中含有D-和L-氨基酸。對各種蛋白質水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶等具有很大的抗性, 也不受蛋白酶抑制劑的影響。與其它抗生素比較, 這是一個優(yōu)點。如果把桿菌肽制成鋅鹽或亞甲基水楊酸鹽, 就比天然產品要穩(wěn)定得多。桿菌肽對多種革蘭氏陽性病原菌, 如葡萄球菌、溶血性鏈球菌、微型球菌、藤黃八疊菌、非溶血性鏈球菌、魏氏梭菌、放線菌以及部分革蘭氏陰性

7、菌均有較強抑制作用。桿菌肽的作用機理是由于能抑制細胞壁所合成的脫磷化過程, 影響磷脂載體的轉運及向細胞壁支架輸送粘肽, 從而抑制細胞壁的合成; 另一方面是與敏感菌的細胞膜結合損傷細胞膜使細胞膜的通透性增加導致內粘質外流; 其次是干擾敏感菌細胞內原漿蛋白的合成?？咕耐ㄟ^摧毀細菌的細胞膜起殺滅作用近年來, 桿菌肽制劑在動物飼料添加劑上的應用取得了巨大的成功, 桿菌肽鋅( Bac-itracin Zine)被美國首先批準作飼料添加劑使用以來, 已為各國批準使用。因其抑菌促生性能良好,比較安全可靠, 成為發(fā)展最快、應用最廣的新型飼料添加劑。我國已于1990 年批準生產與使用國內產品。2.0 抗菌肽生

8、產關鍵技術2.1 高效價抗菌肽菌株的篩選在從昆蟲及試樣中分離出產抗菌肽的細菌菌株共156株,經鑒別其中:短桿菌48株、芽孢桿菌66株及乳酸鏈球菌42株,在初篩過程中，發(fā)酵效價在5000 µ/ml以上者有36株，其中：短桿菌8株、芽孢桿菌22株及乳酸鏈球菌6株,經復篩有15株發(fā)酵效價在5000µ/ml以上，均為枯草芽孢桿菌，以T-1045為最高達10453.3µ/ml，其次為T-1278，T-2856及T-3033均達9926.6 µ/ml。表1 高效價抗菌肽菌株的篩選結果之一菌號ODpH效價（µ/ml）菌落形態(tài)T-10080.215 5.54

9、6915.9較大0.216 5.49 0.214 5.53 T-10430.244 5.50 6916.90.226 5.49 0.223 5.52 T-10450.215 5.63 10453.30.213 5.62 0.213 5.62 T-12110.219 5.43 8952.80.227 5.53 0.207 5.54 T-12780.241 5.48 9926.60.216 5.55 0.226 5.51 T-12980.234 5.54 7668.2中等0.240 5.53 0.244 5.52 T-13440.235 5.52 5073.60.258 5.53 0.252 5.

10、52 T-15760.264 5.54 7668.20.239 5.56 0.236 5.52 表2 高效價抗菌肽菌株的篩選結果之二T-15880.243 5.44 7556.4較小0.233 5.51 0.240 5.50 T-15920.245 5.51 7668.20.252 5.50 0.246 5.51 T-18790.238 5.49 7668.20.226 5.60 0.235 5.49 T-19660.257 5.52 7668.20.236 5.56 0.272 5.49 T-28560.247 5.55 9926.60.245 5.62 0.238 5.66 T-29360

11、.266 5.49 8952.80.262 5.47 0.244 5.47 T-30330.242 5.44 9926.60.255 5.44 0.249 5.44 2.2 T-1045菌株種子及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化2.2.1 T-1045菌株種子培養(yǎng)基配方四因素七水平均勻法設計方案表3 種子培養(yǎng)基配方四因素七水平均勻法設計方案（%）因子蔗糖糖蜜玉米漿粉硫酸銨N12.004.202.200.50N22.603.802.000.65N31.804.000.900.70N41.404.801.500.60N52.203.001.300.55N62.404.401.100.45N71.603.401.70

12、0.402.2.2 T-1045菌株種子培養(yǎng)基配方四因素七水平均勻法實驗結果表4 四因素七水平均勻法實驗結果之一項 目N116h20h24hODpHODpHODpH0.3066.280.3197.340.2907.94N20.2886.220.3356.380.3067.91N30.3436.020.2885.810.3237.05N40.2546.050.2887.280.2927.60N50.2585.990.3286.910.3567.29N60.2766.120.2936.030.3517.08N70.2716.110.2727.620.2717.53表5 四因素七水平均勻法實驗結果之

13、二配方配方編號培養(yǎng)時間培養(yǎng)基成份蔗糖糖蜜玉米漿粉硫酸銨種子配方N-316h 1.804.000.900.70N-161.404.762.20.70N-220h 2.603.802.000.65N-202.604.802.20.70N-520h和24h 2.203.001.300.55N-2424h2.584.000.90.51發(fā)酵配方（一）25h3.505.30 0.84 0.60 注：N16、N20、N24分別為16h、20h、24h理論擬合結果表6 四因素七水平均勻法實驗結果之三種子培養(yǎng)時間配方編號OD*50pHOD*100pH效價(µ/ml)16h種齡N-30.2865.810

14、.194 6.01 83330.204 5.94 0.198 5.87 N-160.3067.160.186 6.13 85760.186 6.14 0.191 6.11 20h種齡N-20.3247.560.212 5.93 84760.182 5.90 0.212 5.94 N-50.2957.150.210 6.32 93040.204 6.37 0.207 6.44 N-200.3626.560.176 5.96 116670.201 5.89 0.202 5.92 24h種齡N-50.326.720.185 6.33 91060.175 6.41 0.171 6.32 N-240.3

15、496.190.204 5.97 93670.208 5.94 0.2215.93 上述結果表明:種子N-20配方，發(fā)酵20h，效價最高達11667µ/ml。2.2.3 T-1045菌株種子及發(fā)酵培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結果2.2.3.1 T-1045菌株種子培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結果表7 T-1045菌株種子培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結果配方PHOD生物量效價(µ/ml)1016.990.28338.0%173001025.450.11514.0%147301036.820.21717.4%150061047.780.24820.6%10767原配方6.420.12710.0%118682.2.3.2

16、 T-1045菌株發(fā)酵培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結果表8 T-1045菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結果配方編號PHOD生物量效價(µ/ml)2016.70 0.24316%242802025.47 0.20811%256702036.40 0.29616%23450原配方7.15 0.31414%119662.2.3.3 T-1045菌株發(fā)酵培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結果表9 T-1045菌株發(fā)酵培養(yǎng)基綜合優(yōu)化結果配方編號PHOD生物量效價(µ/ml)平均效價(µ/ml)3017.35 0.43722%27670276237.40 0.44222%275763026.38 0.16511%2480

17、6248096.34 0.17411%248113037.31 0.39223%21495214317.28 0.39427%213673047.11 0.42926%973097037.11 0.38926%9675原配方6.02 0.20712%11795117896.06 0.20312%118056.11 0.20212%11766上述結果表明:種子培養(yǎng)基以編號101最高,達17300µ/ml,發(fā)酵培養(yǎng)基以編號202最高,達25670 µ/ml,綜合優(yōu)化培養(yǎng)基以編號301最高,達27623 µ/ml，比原配方11789µ/ml，提高了134.3%

18、，效果極為顯著，實現了預定的技術指標。2.2.4 T-1045菌株發(fā)酵配方優(yōu)化及產品載體比較表10 T-1045菌株發(fā)酵配方優(yōu)化及產品載體比較之一配方編號種子培養(yǎng)時間種子培養(yǎng)結果發(fā)酵培養(yǎng)時間發(fā)酵培養(yǎng)結果OD值PH值OD值PH值效價（(µ/ml)40124h0.1876.3848h0.2907.492096040224h0.1976.7530h0.1946.731835740320h0.1246.4425h0.2155.1321505 表11 T-1045菌株發(fā)酵配方優(yōu)化及產品載體比較之二配方編號載體濕樣干樣水分（%）效價（µ/g）水分（%）效價（µ/g）401膨化

19、玉米44.58851313.7316625麩皮49.9662319.2518944402膨化玉米49.36630813.6014590麩皮52.4033359.9616625403膨化玉米41.83887111.9518944麩皮49.1165227.0319752上述結果表明:2.2.4.1 T-1045菌株發(fā)酵配方優(yōu)化以編號403配方為最佳，發(fā)酵效價達21505µ/ml。2.2.4.2 抗菌肽產品載體比較了膨化玉米和麩皮，這兩者均可作為載體，但麩皮效價稍高。2.3 抗菌肽產品穩(wěn)定性試驗 為了考核抗菌肽產品的穩(wěn)定性，進行了24個月在室溫條件下的效價變化，具體見表25和圖1。表12

20、抗菌肽產品在室溫條件下的效價變化 年-月月平均溫度（）效價（µ/g）2010-1025.3225002010-1121.9220002010-1219.0210002011-0112.9200002011-0214.3195002011-0317.2193002011-0423.5190002011-0525.4188002011-0631.7185002011-0732.6181002011-0832.5176002011-0929.7175002011-1025.5170002011-1122.5165002011-1216.2161002012-0113.3157002012-

21、0213.0150002012-0316.6143002012-0422.4140002012-0526.0120002012-0629.6110402012-0733.4105402012-0832.0101402012-0929.610040圖1. 抗菌肽產品在室溫條件下的效價變化上述結果表明:抗菌肽產品在室溫條件下，經2年時間起始效價由22500µ/g下降到10040µ/g，下降率僅為55.4%。而1年的下降率僅22.2%，說明該產品具有相當好的穩(wěn)定性，此項試驗仍在繼續(xù)進行中。3.0 抗菌肽應用效果3.1 抗菌肽對仔豬喂養(yǎng)試驗及其效果3.1.1 試驗分組：采用單因子濃

22、度梯度法設計，試驗設2組：對照組、0.3%生物抗菌肽組。每個組設4個重復，每個重復12頭仔豬下表。試驗分組序號項目對照組試驗組1生物抗菌肽添加水平00.3%2仔豬頭數（頭）48483.1.2 試驗材料：試驗選用28日齡斷奶、遺傳背景相同、體重相近的仔豬隨機分組。3.1.3 抗菌肽產品效價：8320µ/g3.1.4 試驗日糧：按試驗豬場正常使用日糧，生物抗菌肽按試驗分組中的添加水平添加，直接加到配合飼料中制?；虬枇巷曃?。3.1.5 試驗時間：2012年1月5日起到2月4日結束，共30天。3.1.6 試驗情況：按豬場正常飼養(yǎng)管理程序進行，試驗期間自由采食、飲水，正試期間記錄每天的飼料消耗量、腹瀉情況，試驗開始和試驗結束禁飼(自由飲水) 24h 后空腹稱重。經過30天的飼養(yǎng)試驗，仔豬未出現疫情，沒有出現死亡現象。仔豬腹瀉方面，對照組偶爾有小豬腹瀉，但情況不嚴重，康復較快，而試驗組未腹瀉現象極少。從皮毛質量方面看，試驗組明顯好于對照組。試驗具體數據如表1：表13 抗菌肽對仔豬養(yǎng)殖試驗效果序號項目對照組試驗組1生物制劑添加水平00.3%2仔豬頭數（頭）48483初始總重（kg）4364384初始均重（kg/頭）9.109.135總耗料量（kg）98611026日均采食量（kg/頭.天）0.6850.7657試