Survivin基因真核表達載體的構建及其在cos7中的表達

1、Survivin基因真核表達載體的構建及其在cos-7中的表達 作者：李紅李明紅楊樺鐔旭民 【摘要】 目的克隆人survivin基因并在真核細胞中表達。方法 以人喉癌組織中提取總RNA為模版，采用反轉錄聚合酶鏈RT-PCR法獲得survivin cDNA。將該基因克隆到pcDNA3.0載體中,構建真核細胞表達載體pcDNA3.0/survivin，將測序正確的survivin基因通過脂質體介導下轉染cos-7，Western blot檢測survivin蛋白在cos-7中表達。結果 DNA測序證明獲得了survivin基因，其序列與GeneBank中報道序列完全一致。Western blot檢

2、測survivin蛋白獲得高效表達，其相對分子質量為16.5kD。結論 Survivin基因的克隆和表達均獲得了成功，為進一步探討survivin基因在喉癌診治中應用奠定了基礎。 【關鍵詞】 survivin基因人喉癌組織基因表達Construction of Survivin Eukaryotic Expression Vector and Its Expression in cos-7 Abstract: Purpose To clone and express human survivin gene with eukaryotic vector. Methods Total mRNA w

3、as extracted from human laryngeal cancer tissue, and then the full-length survivin cDNA was obtained by RT-PCR. The surivin gene was cloned into pcDNA3.0 vector and the pcDNA3.0/survivin vector was constructed and transfected into cos-7 cells. The survivin protein was analyzed by western blot. Resul

4、ts The cDNA of survivin was sequenced and consistent with the sequence reported in Genebank with blast。 Western blot analysis demonstrated that the survivin protein was expressed and the relatived molecular mass was about 16.5kD. Conclusions survivin gene has been cloned and expressed successfully a

5、nd can be used for further study the applications of survivin on diagnosis and therapy in the laryngeal cancer. Key words: survivin gene; eukaryotic expression; vector construction Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成員，其功能主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細胞凋亡過程。該蛋白選擇性地表達于胚胎發(fā)育

6、組織和人類大多數(shù)腫瘤組織，而正常成人終末組織中不表達，其獨特的分布特點在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用已受到學者們的廣泛關注。為了進一步探討該基因在人喉癌組織中的表達及其在喉癌診斷及預后判斷中的作用，我們構建了survivin基因的真核表達載體并將其轉染cos-7細胞以觀察該基因在其中的表達情況，為下一步喉癌的診斷和治療提供新的理論依據。 1 材料與方法 1.1 材 料 人新鮮喉癌組織、pcDNA3.0質粒和猴成纖維細胞cos-7細胞系及DH5菌株均為本科保存。限制性內切酶及胰蛋白酶購于寶生物工程(大連)有限公司；T4DNA連接酶、DNA純化試劑盒和逆轉錄試劑盒購于Promega公司，用于組織

7、總RNA提取的Tripure Isolation Reagent提取試劑盒購于Gibco公司。轉染試劑Lipofectamine Reagent 2000和G418購于Gibco公司，survivin兔抗人多克隆抗體購自于Santa cruz公司。 1.2 方 法 1.2.1 PCR引物設計 根據Gene Bank中survivin序列，設計一對引物， P1(survivin基因上游引物，5GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG； 3P2(survivin基因下游引物，5GCCCTCGAGTCAATCCATGGCAGC 3。在上游和下游引物5端分別加入了BamH和Xho酶切位點，以便

8、于克隆。引物由上海博亞生物有限公司合成。 1.2.2 目的基因survivin片段的獲得 取手術切除的人新鮮喉癌組織，機械搗碎后，消化收集、洗滌、沉淀，以Tripure Isolation Reagent 總RNA試劑提取總RNA(詳見試劑操作說明)，按產品說明書操作，以反轉錄體系經RT-PCR制備survivin cDNA，反應如下:取總RNA 1，oliga dT 2l，混勻后70 10min，冰浴2min后加5倍逆轉錄緩沖液5l，10mmol/L dNTP 2l，RNA酶抑制劑2l，逆轉錄酶(MLV RT)40，混勻后42水浴60min，冰浴2min，70加熱10min后模板制備完畢。以

9、所制備survivin cDNA為模板進行35個PCR反應擴增，反應體系如下:模板cDNA 8l，10倍緩沖液10l，25mmol/L MgCl2 10l，上、下游引物(10/)4l，TagDNA聚合酶2l，10mmol/L dNTP2l，加2補足至總體積100l。反應條件為:94 5min，52 2min，72 2min后94 1min，52 1min，72 2min，35個循環(huán)，最后72繼續(xù)延伸10min。取5l PCR產物，在含0.5mg/溴化乙錠(EB)的瓊脂糖凝膠(15/)中電泳分析，紫外觀測儀觀察結果。 1.2.3 Survivin基因的克隆及真核載體pcDNA3.0/surviv

10、in的構建 回收純化的產物經BamH/Xho雙酶切并回收,取10l回收片段，加經BamH/Xho雙酶切的pcDNA3.0質粒2l，加T4DNA連接酶1l、10×buffer 2l、雙蒸水5l，4過夜進行連接，構建重組質粒，命名為pcDNA3.0/survivin。取連接產物10l轉化感受態(tài)細胞DH5 100l，與培養(yǎng)液混勻,倒入含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，用涂菌棒均勻涂平，置37孵箱過夜。用牙簽隨機挑取單個菌落，置搖菌管中，37恒溫振蕩器搖菌16。移菌液至離心管中，離心棄上清,按試劑盒說明書介紹進行質粒的抽提和純化。同時取1ml菌種送上海生工測序。抽提純化的重組質粒4l，加10&

11、#215;buffer 1l，BamH和Xho各0.5l，雙蒸水4l，置37恒溫箱進行酶切1，進行瓊脂糖凝膠電泳。 1.2.4 細胞轉染及穩(wěn)定轉染細胞系的建立 cos-7細胞在含100ml/新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%左右，在脂質體介導下將重組質粒pcDNA3.0/survivin進行轉染，具體方法參照轉染試劑說明書進行。418(濃度為500/ml)篩選。 1.2.5 Western blot印跡 分別取3×107個穩(wěn)定轉染空載體pcDNA3.0(+)及重組質粒pcDNA3.0/survivin的cos-7細胞，裂解后加入3×加樣緩沖液混勻，沸水中煮10min，

12、離心，經15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在轉移槽中將蛋白從凝膠中的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上(電壓14，冷室內過夜)，麗春紅染液預染并標記蛋白分子量。TBST緩沖液洗膜、封閉過夜。加TBST緩沖液稀釋的兔抗人survivin多克隆抗體(1200)作為一抗，37孵育15，加堿性磷酸酶標記IgG(1400)作為二抗，孵育、洗膜后，將膜浸入10ml堿性磷酸酶底物緩沖液與33四唑氮藍(NBT)和66(BCIP)制成的顯色液，室溫閉光顯色20min，蒸餾水終止反應。 2 結 果 2.1 Survivin基因的獲得與鑒定 以逆轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR電泳結果顯示一條約

13、為425大小的特異性條帶。此DNA帶與survivin基因的大小相符合(425)，圖中未見有其他非特異擴增帶出現(xiàn)(圖1)。將該DNA帶回收后，DNA測序結果表明，經逆轉錄PCR獲得的DNA片段為survivin基因，其DNA序列與GeneBank中報道的survivin基因序列吻合。 2.2 Survivin基因的克隆及真核表達載體pcDNA3.0/survivin的酶切結果 Survivin基因插入表達載體后，提取獲得的重組質粒pcDNA3.0/ survivin，以雙酶切鑒定，鑒定結果發(fā)現(xiàn)其中有一425bp的條帶為轉染基因survivin產物。 2.3 Survivin蛋白表達 將正確的重

14、組菌在37活化過夜，經IPTG誘導表達后做SDS-PAGE分析，從電泳圖可以看出在表達蛋白理論相對分子質量(16.5×103)對應處出現(xiàn)了一條新的表達帶。 3 討 論 近年來已陸續(xù)有文獻報道survivin蛋白在頭頸部腫瘤組織中的表達13 ，本文通過分子生物學方法克隆擴增喉癌組織中survivin基因，構建真核表達載體，并轉染cos-7細胞，為下一步研究survivin基因并探索腫瘤的生物治療奠定基礎。 Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白家族的新成員，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的一種凋亡抑制蛋白4，主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細

15、胞凋亡過程，而且能在細胞有絲分裂前期通過與紡錘體微管發(fā)生特異性結合反應，使腫瘤細胞逃避細胞周期2/期檢測點的監(jiān)控，抵抗因DNA損傷和突變自身誘導的細胞凋亡，從而導致腫瘤細胞異常分裂增殖。Survivin主要表達于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，同時高表達于多種腫瘤組織和轉化細胞，在成人各種正常器官中檢測不到。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、口腔鱗癌、鼻咽癌和造血系統(tǒng)腫瘤中survivin均過度表達5，6。由于survivin僅特異性地表達于腫瘤組織，在正常成人組織幾乎不表達，使得應用survivin特異性抗體作免疫治療、決定基因突變以及反義survivin基因治療具有良好的靶向性、特

16、異性及安全性，具有成為喉癌治療的潛在新靶點7，8。 我們以人喉癌組織總RNA為模板，擴增survivin基因，插入原核表達載體，成功地表達了survivin蛋白。不僅證實了survivin在喉癌組織中有表達，而且為進一步研究其在喉癌及其他惡性腫瘤的診斷、靶向性治療及預后判斷中的應用意義奠定了基礎。 但有關survivin促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的許多環(huán)節(jié)還不清楚。隨著對survivin研究的進一步深入，survivin在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制必將進一步闡明，而survivin的靶向腫瘤療法及針對性開發(fā)新的抗腫瘤藥物對腫瘤的治療將具有深遠的意義。【參考文獻】 1 Salz W, Eisenberg

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18、i, 2004, 9(6):356-359.3 Badran A, Yoshida A, Ishikawa K, et al. Identification of a novel splice variant of the human anti-apoptopsis gene survivinJ. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 314(3):902-907.4 Pisarev V, Yu B, Salup R. Full-length dominant-negative survivin for cancer immunotherapyJ. Clin Cabcer Res, 2003, 9(17): 6523