烏司他丁對膿毒癥大鼠肺微血管通透性及肺組織PEDF表達(dá)的影響

1、烏司他丁對膿毒癥大鼠肺微血管通透性及肺組織PEDF表達(dá)的影響 作者：蔡施霞，鄧烈華，佟琳，孫小聰【摘要】 目的 觀察烏司他丁注射液對膿毒癥大鼠肺微血管通透性及肺組織色素上皮衍生因子(PEDF)表達(dá)的影響，探討烏司他丁對膿毒癥大鼠肺保護(hù)的作用機(jī)制。方法 30只健康的雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(A組)、陽性對照組(B組)、烏司他丁治療組(C組)，每組10例。除假手術(shù)組外，其他組均施行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型，治療組同時給予烏司他丁腹腔注射(100ku/kg)，術(shù)后4h隨機(jī)處死大鼠5只取組織標(biāo)本，剩余5只大鼠經(jīng)頸外靜脈注射伊文思藍(lán)觀察肺微血管通透性。分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反

2、應(yīng)(RT-PCR)法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測肺組織中PEDF的表達(dá)。結(jié)果 B組肺微血管通透性明顯高于A、C組，C組肺微血管通透性高于A組;B組肺組織PEDF表達(dá)水平明顯低于A、C組，C組肺組織PEDF表達(dá)水平低于A組(P<0.05)。結(jié)論 烏司他丁能明顯抑制膿毒癥大鼠肺微血管通透性增高，這種肺保護(hù)作用的機(jī)制可能與增加PEDF表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 烏司他丁注射液;膿毒癥;肺微血管通透性;PEDF【Abstract】 Objective To observe the permeability of pulmonary microvascular and expressio

3、n of Pigment epithelium-derived factor in septic rats treated with Ulinastatin injection, and to investigate the action mechanism of Ulinastatin in in pulmonary function protect.Methods A total of 30 healthy male SD rats were randomly divided into three groups, and each group has 10 rats,Group A rec

4、eived sham operation and the others underwent cecal ligation and puncture (CLP) operation.All the rats were accepted intraperitoneal injection of normal saline (group A,B) or Ulinastatin (100ku/kg). After four hours, Lung tissue express of PEDF in all rats were detected by reverse transcription-poly

5、merase chain reaction(RT-PCR) and Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) methods respectively and the permeability of pulmonary vascular were observed by injecting Evans Blue into jugular vein of rats. Results The permeability of pulmonary microvascular in group B were significantly higher than gr

6、oup A and C,which in group C were higher than group A.The expression levels of PEDF in group B were significantly lower than group A and C,which in group C were lower than group A.Conclusions Ulinastatin is a reliable protection agent for septic induce acute lung injury, and its mechanism of action

7、may be involved in the increase of PEDF expression.【Key words】 Ulinastatin injection;Sepsis;Pulmonary microvascular;PEDF膿毒癥(sepsis) 是合并感染的全身性炎癥反應(yīng)綜合征( systemic inflammation response syndrome, SIRS)，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS),其中呼吸功能障礙發(fā)生率較高, 出現(xiàn)時間早,其主要的病理生理改變?yōu)榉蚊?xì)血管通透性增加。而色素上皮衍生因子(PEDF)可使血管通透性降低，雖然臨床研究證實烏司

8、他丁有明確的肺保護(hù)作用，但其作用機(jī)制仍有待研究，本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型觀察烏司他丁對膿毒癥大鼠肺微血管通透性和PEDF影響，探討烏司他丁對膿毒癥大鼠肺微血管通透性影響及其作用機(jī)制。1 材料與方法1.1 動物實驗分組 SPF級SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量250300g(由廣東醫(yī)學(xué)院動物中心提供),按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組:假手術(shù)組(A組)，無菌狀態(tài)下開腹尋找到盲腸后再將其還納腹腔,然后逐層關(guān)腹,術(shù)后立即腹腔注射生理鹽水(NS)2ml;CLP組(B組)，CLP后立即腹腔注射NS 2ml;烏司他丁(UTI)治療組(C組), CLP后立即腹腔注射UTI 20ku/kg,加NS

9、至2ml。術(shù)后4h隨機(jī)選取5只頸外靜脈注射伊文思藍(lán)液，剩余5只大鼠活殺取肺組織標(biāo)本。為避免伊文思藍(lán)影響肺組織PEDF表達(dá)測定，隨機(jī)各取5只大鼠實驗。1.2 CLP模型制備方法2 動物在乙醚吸入麻醉下無菌開腹手術(shù),在距盲腸末端1cm處用7號絲線結(jié)扎盲腸,用22G針頭在被結(jié)扎盲腸上對穿3次,注意避免糞便污染,并用生理鹽水2ml濕潤腸管,按生理位置還納腸管。術(shù)畢逐層關(guān)腹,并于腹壁皮下注射林格氏液50ml/kg抗休克處理。術(shù)后自由進(jìn)食水。1.3 觀察指標(biāo)及標(biāo)本處理 觀察大鼠術(shù)后活動、進(jìn)食、豎毛、腹瀉、眼球凹陷、呼吸以及活殺后腹腔腸管擴(kuò)張、充血、腹水、病灶包裹、肝腫大、肺表面充血等情況?；顨⑷?biāo)本時大鼠

10、在乙醚吸入麻醉下,開腹留取右葉肺緣組織100mg,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后立即置液氮凍存,置-80冰箱待逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測肺組織PEDF mRNA表達(dá)。取右下肺組織200mg,快速PBS漂洗兩次后,置碾缽中用液氮制備肺組織勻漿, 采用酶聯(lián)免疫吸附ELISA法檢測肺組織PEDF蛋白表達(dá)。1.4 檢測肺組織PEDF mRNA表達(dá) 采用RT- PCR技術(shù)檢測。取肺組織100mg置碾缽中用液氮制備肺組織勻漿,采用Trizol(Sigma公司)一步法提取肺組織總RNA。采用兩步法RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司)進(jìn)行RT-PCR, 以GAPDH作為內(nèi)參照,以10l

11、擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)115%瓊脂糖凝膠電泳后,用LabWork 410 UVP成像系統(tǒng)照相并分析結(jié)果。以目的基因與內(nèi)參照在凝膠上的灰度值比值為基因表達(dá)的相對含量。大鼠PEDF序列(擴(kuò)增片段為374bp):上游5'-CCCCATGATGTCAGACCCTA -3',下游5'-GGGGACTCAAACAAGGACTG-3', PCR反應(yīng)條件: 942min預(yù)變性, 9460s變性, 5630s退火, 7250s延伸,共計30個循環(huán), 72 7min延伸。RT-PCR操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。1.5 檢測肺組織PEDF蛋白表達(dá) 采用ELISA法檢測。嚴(yán)格按照大鼠血管內(nèi)皮生

12、長因子ELISA試劑盒(武漢中美科技有限公司)說明書操作，酶標(biāo)儀(BIO-RAD680)波長450nm下讀取吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出PEDF濃度。1.6 肺微血管通透性的測定 (1)伊文思藍(lán)含量測定法。按20mg/kg經(jīng)左側(cè)頸外靜脈注射2%伊文思藍(lán)液(北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司)，30min后將動物麻醉開胸取部分左肺，剪去周圍組織，吸干表面水分及血液，稱量濕質(zhì)量，將肺組織剪成約10mm3 小塊浸泡于甲酰胺溶液中(0.2g/kg) ，置60恒溫水浴中抽提24h，待組織中色素全部浸出，取出組織，離心，取上清液，在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的條件下，用紫外分光光度計(島津2000)在620nm波長處進(jìn)行比色測定光

13、密度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出EB含量，以每克肺組織干重含EB質(zhì)量表示。(2)濕/干質(zhì)量比測定:稱肺組織濕質(zhì)量后，置烤箱80，72h，稱干質(zhì)量，計算濕/干質(zhì)量比值。1.7 數(shù)據(jù)處理 采用SAS v8.1統(tǒng)計軟件包對所得資料進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用SNK-q檢驗,P<0.05為差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 大鼠一般情況觀察 B組大鼠術(shù)后2h活動度即明顯下降,并逐漸表現(xiàn)出厭食、豎毛、眼球下陷、呼吸急促、對外界刺激反應(yīng)淡漠等。腹腔腸系膜充血、腸管顯著擴(kuò)張、被結(jié)扎盲腸壞死、血性腹水、病灶處大網(wǎng)膜包裹不佳、肝腫大、肺充血明顯。C組亦有厭食、豎毛、活動度減少等情況,但明顯較B組輕微,且C組腸管僅

14、輕度擴(kuò)張,腹水減少,壞死盲腸被大網(wǎng)膜及周圍腸管包裹明顯。A組沒有相關(guān)表現(xiàn)。2.2 大鼠肺組織PEDF mRNA表達(dá) B組明顯低于A、C組，C組低于A組(P<0.05)，見表1。2.3 大鼠肺組織PEDF蛋白表達(dá) B組明顯低于A、C組，C組低于A組(P<0.05)，見表1。2.4 肺組織EB含量 B組明顯高于A、C組，C組高于A組(P<0.05)，見表1。2.5 肺組織濕/干質(zhì)量比 B組明顯高于A、C組，C組高于A組(P<0.05)，見表1。表1 各組大鼠實驗測定值注：*P<0.05compared with group A，

15、#P<0.05 compared with group B3 討論膿毒癥主要表現(xiàn)為系統(tǒng)炎癥和器官功能損害，而微血管通透性增高是器官功能受損的重要特征之一。血管通透性增高，一方面使大量液體滲入組織間隙，增加毛細(xì)血管與細(xì)胞間的距離，加重組織細(xì)胞的缺氧;另一方面還使炎癥細(xì)胞過多聚集于局部組織，通過釋放蛋白酶及氧自由基等，直接造成組織細(xì)胞的損傷1。國外學(xué)者的研究顯示,組織的缺血缺氧可使組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)增強(qiáng)2。VEGF是一種特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，是目前已知的最強(qiáng)烈的血管滲透劑，低氧和VEGF 能調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloprotein

16、ases,MMPs)的活性, PEDF是MMPs-2和MMPs-9的作用底物,這樣,低氧和VEGF通過MMPs的蛋白溶解作用使PEDF 水平下調(diào), VEGF/PEDF升高,病理變化隨之發(fā)生3。PEDF 能夠阻止缺氧導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物VEGF- C 及其受體VEGF- R3 的減少，VEGF- C、 VEGF- R3 轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定阻止低氧環(huán)境中血管的滲漏4，5。烏司他丁注射液是從人尿中提取的一種具有廣譜蛋白酶抑制作用的糖蛋白，研究證實它可以有效抑制膿毒癥向多器官功能障礙綜合征(MODS)轉(zhuǎn)化，可有效降低膿毒癥患者的死亡率6，國內(nèi)外目前并未見有關(guān)烏司他丁對膿毒癥血管通透性影響的報道。本研究通過向膿毒

17、癥大鼠頸外靜脈內(nèi)注射伊文思藍(lán)測定肺組織對這種染料的通透性，證實烏司他丁可以阻止大鼠微血管通透性增高的推測，進(jìn)一步了解烏司他丁治療膿毒癥的作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)外源性給予烏司他丁后，大鼠微血管通透性明顯降低，同時亦檢測到大鼠肺組織PEDF的表達(dá)較CLP組明顯升高。我們推測烏司他丁可能通過增加大鼠肺組織PEDF的表達(dá)降低大鼠微血管通透性，從而起到肺保護(hù)作用。這與國外相關(guān)研究7,8表明在膿毒癥患者血清中色素上皮衍生因子(PEDF)顯著降低，PEDF可使血管通透性降低是一致的。當(dāng)然對于膿毒癥發(fā)生及發(fā)展過程肺組織表達(dá)的動態(tài)變化以及烏司他丁作用的時間依賴性，還有待于我們進(jìn)一步深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Pe

18、dram A,Razandi M,Levin ER.Deciphering vascular endothelial cell growth factor/vascular permeability factor signaling to vascular permeability. Inhibition by atrial natriuretic peptide.J Biol Chem,2002,277(46):44385-44398.2 Becker PM, Alcasabas A, Yu AY, et al. Oxygen - independent upregulation of va

19、scular endothelial growth factor and vascular barrier dysfunction during ventilated pulmonary ischemia in isolated ferret lungs. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000,22(3):272-279.3 Notari L,Miller A,Martinez A, et al. Pigment ep ithelium derived factor is a substrate form matrix metallop roteinase type 2 and type 9: imp lications for down regulation in hypoxia.Invest Ophthalmol Visl Sci, 2005, 46: 2736-2747.4 Yamagishi S, Matsui T, Nakamura K,et al. Pigment- epithelium- derived factor (PEDF)inhibits angioten