生物化學(xué)第四章酶

1、第三章第三章 酶酶 學(xué)學(xué) 周口師范學(xué)院生命科學(xué)系周口師范學(xué)院生命科學(xué)系 一、一、 酶的概述酶的概述 二、二、 酶的分類與命名酶的分類與命名 三、三、 酶催化作用特性的分子機(jī)理酶催化作用特性的分子機(jī)理 四、四、 酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué) 五、五、 重要的酶類及酶活性的調(diào)控重要的酶類及酶活性的調(diào)控 主要內(nèi)容主要內(nèi)容一一. . 酶的概述酶的概述酶概念酶概念酶是生物體活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化活性和特定空間構(gòu)象的生物大分子，包括蛋白質(zhì)及核酸，又稱為生物催化劑(Biocatalysts) 。絕大多數(shù)的酶都是蛋白質(zhì)(Enzyme和Ribozyme)酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，稱為酶促反應(yīng)(Enzymati

2、c reaction)。在酶的催化下發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)，稱為底物(substrate)。1897年，酶的發(fā)現(xiàn)和提出：Buchner（1911諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）兄弟用不含細(xì)胞的酵母汁成功實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵。提出了發(fā)酵與活細(xì)胞無(wú)關(guān)，而與細(xì)胞液中的酶有關(guān)。1913年，Michaelis和Menten提出了酶促動(dòng)力學(xué)原理米氏學(xué)說(shuō)。1926年，Sumner從刀豆種子中分離、純化得到了脲酶結(jié)晶，首次證明酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)。1982年，Cech對(duì)四膜蟲(chóng)的研究中發(fā)現(xiàn)RNA具有催化作用?？寺∶?、遺傳修飾酶克隆酶、遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶蛋白質(zhì)工程新酶生物催化劑生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質(zhì)類：蛋白質(zhì)類：

3、Enzyme (天然酶、生物工程酶天然酶、生物工程酶)核酸類：核酸類：Ribozyme ; Deoxyribozyme模擬生物催化劑模擬生物催化劑 酶的化學(xué)本質(zhì)酶的化學(xué)本質(zhì) 大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)（大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)（Most enzymes are proteins） 1926年美國(guó)Sumner 脲酶的結(jié)晶，并指出酶是蛋白質(zhì) 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結(jié)晶，并進(jìn)一步證明了酶是蛋白質(zhì)。 20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)某些RNA有催化活性，還有一些抗體也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)概念受到很大沖擊。某些核酸也有酶活性某些核酸也有酶活性 酶是有

4、催化能力的蛋白質(zhì)酶是有催化能力的蛋白質(zhì)酶和一般催化劑的共性酶和一般催化劑的共性1. 用量少而催化效率高；用量少而催化效率高；2. 它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不 能能改變化學(xué)反應(yīng)平衡。酶本身在反應(yīng)前后也不改變化學(xué)反應(yīng)平衡。酶本身在反應(yīng)前后也不發(fā)生變化。發(fā)生變化。3. 酶能夠穩(wěn)定底物形成的過(guò)渡狀態(tài)，降低反酶能夠穩(wěn)定底物形成的過(guò)渡狀態(tài)，降低反應(yīng)的活化能，從而加速反應(yīng)的進(jìn)行。應(yīng)的活化能，從而加速反應(yīng)的進(jìn)行。 酶的催化作用可使反應(yīng)速度提高10 101倍。如：過(guò)氧化氫分解 2H2O2 2H2O + O2. 用Fe3+ 催化，效率為6X10-4 mol/mol.S，而用過(guò)

5、氧化氫酶催化，效率為6X106 mol/mol.S。 -淀粉酶催化淀粉水解，1克結(jié)晶酶在65C條件下可催化2噸淀粉水解。1 1高效性高效性 是指酶在催化生化反應(yīng)時(shí)對(duì)底物的選擇性，即一種酶只能作用于某一類或某一種特定的物質(zhì)。亦即酶只能催化某一類或某一種化學(xué)反應(yīng)。 如：蛋白酶催化蛋白質(zhì)的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。2. 2. 酶的專一性酶的專一性l酶促反應(yīng)一般在pH 5-8 水溶液中進(jìn)行，反應(yīng)溫度范圍為20-40C。l高溫或其它苛刻的物理或化學(xué)條件，將引起酶的失活。3. 3. 酶反應(yīng)條件的溫和性酶反應(yīng)條件的溫和性如抑制劑調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等。4.

6、 4. 酶活力的可調(diào)控性酶活力的可調(diào)控性5.5.某些酶活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)某些酶活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)根據(jù)酶的組成成分根據(jù)酶的組成成分 單純酶單純酶(simple enzyme)(simple enzyme)是基本組成單位僅為氨基酸是基本組成單位僅為氨基酸的一類酶。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。的一類酶。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均屬此列。屬此列。 復(fù)合酶復(fù)合酶(conjugated enzyme)(conjugated enzyme)的催化活性，除蛋白質(zhì)的催化活

7、性，除蛋白質(zhì)部分部分( (酶蛋白酶蛋白apoenzyme)apoenzyme)外，還需要非蛋白質(zhì)的物質(zhì)，即外，還需要非蛋白質(zhì)的物質(zhì)，即所謂酶的所謂酶的輔助因子輔助因子(cofactors)(cofactors)，兩者結(jié)合成的復(fù)合物稱，兩者結(jié)合成的復(fù)合物稱作作全酶全酶(holoenzyme)(holoenzyme)，即：，即：二二 . . 酶的分類與命名酶的分類與命名12根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及組織形式根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及組織形式1.1.單體酶單體酶 ：只含一條肽鏈，分子量小，大多數(shù)水解酶 屬于此類。 2.2.寡聚酶：寡聚酶：由相同或不同的若干亞基構(gòu)成。每條肽鏈?zhǔn)且粋€(gè)亞基，單獨(dú)的亞基無(wú)酶的活力。如乳酸脫

8、氫酶含四個(gè)亞基。3.3.多酶復(fù)合體：多酶復(fù)合體：若干個(gè)功能相關(guān)的酶彼此嵌合形成的復(fù)合體。每個(gè)單獨(dú)的酶都具有活性，當(dāng)它們形成復(fù)合體時(shí)，可催化某一特定的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，如脂肪酸合成酶復(fù)合體，含有六個(gè)酶及一個(gè)非酶蛋白質(zhì)。 根據(jù)酶的存在位置根據(jù)酶的存在位置1.1.胞內(nèi)酶：胞內(nèi)酶：在合成分泌后定位于細(xì)胞內(nèi)發(fā)生作用的酶，大多數(shù)的酶屬于此類。2.2.胞外酶：胞外酶：在合成后分泌到細(xì)胞外發(fā)生作用的酶， 主要為水解酶。1961年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：酶國(guó)際系統(tǒng)分類法酶國(guó)際系統(tǒng)分類法1. 氧化氧化-還原酶類還原酶類 Oxido-reduc

9、tases 2. 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移(移換移換)酶類酶類 Transferases3 . 水解酶類水解酶類 hydrolases4 . 裂合（裂解）酶類裂合（裂解）酶類 Lyase5. 異構(gòu)酶類異構(gòu)酶類 Isomerases6. 合成酶類合成酶類 Ligases or Synthetasesl氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。l主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。l如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1. 1. 氧化氧化- -還原酶類還原酶類 Oxido-reductasesOxido-reductasesCH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOO

10、HONADHl轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2. 2. 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移( (移換移換) )酶類酶類 TransferasesTransferasesCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHOl水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。l主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。l例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：3. 3. 水解酶類水解酶類 hydrolaseshydrolasesH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHl主要包括醛縮

11、酶、水化酶（脫水酶）及脫氨酶等。l裂合酶:催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子而形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。lA + B = A-Bl例如， 蘋(píng)果酸裂合酶即延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。4 . 4 . 裂合（裂解）酶類裂合（裂解）酶類 LyaseLyaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOHl異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過(guò)程。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。5. 5. 異構(gòu)酶類異構(gòu)酶類 IsomerasesIsomerasesl合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)

12、相互偶聯(lián)。lA + B + ATP + H-O-H = A-B+ ADP +Pi l例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6. 6. 合成酶類合成酶類 Ligases or SynthetasesLigases or Synthetases1.1.習(xí)慣命名法習(xí)慣命名法: :l根據(jù)其催化底物來(lái)命名（蛋白酶；淀粉酶）l根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來(lái)命名（水解酶；轉(zhuǎn)氨酶；裂解酶等）l結(jié)合上述兩個(gè)原則來(lái)命名（琥珀酸脫氫酶）l有時(shí)在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來(lái)源或其它特點(diǎn)（胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性磷酸脂酶和酸性磷酸脂酶）。酶的命名酶的命名系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。例

13、如：l習(xí)慣名稱：谷丙轉(zhuǎn)氨酶l系統(tǒng)名稱： 丙氨酸: -酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶l酶催化的反應(yīng)： l-酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸 乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 EC 1. 1. 1. 27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號(hào)l 酶催化的中間產(chǎn)物理論酶催化的中間產(chǎn)物理論l 酶的活性中心酶的活性中心l 酶作用專一性及其機(jī)理酶作用專一性及其機(jī)理l 酶高效催化的分子基礎(chǔ)酶高效催化的分子基礎(chǔ)三、酶催化作用特性的機(jī)理三、酶催化作用特性的機(jī)理酶的催化作用與分子活化能酶的催化作用與分子活化能在一個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系中，只有那些具有較高能量，處于活化狀態(tài)的分子才

14、能在分子碰撞中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。活化分子比一般常態(tài)分子高出的能量稱之為活化能?；罨埽悍肿佑沙B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需的能量。是指在一定溫度下，1mol 反應(yīng)物全部進(jìn)入活化狀態(tài)所需的自由能。 化學(xué)反應(yīng)要能夠發(fā)生，關(guān)鍵的是反應(yīng)體系中的分子必須分子處于活化狀態(tài)，活化分子比一般分子多含的能量就稱為活化能。反應(yīng)體系中活化分子越多，反應(yīng)就越快。增加反應(yīng)體系的活化分子數(shù)有兩條途徑:一是向反應(yīng)體系中加入能量 ，另一途徑是降低反應(yīng)活化能。酶的作用就在于降低化學(xué)反應(yīng)活化能。例 2H2O22H2O+O2 反 應(yīng)活化能非催化反應(yīng)75.24kJ/mol鈀催化反應(yīng)48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/molE+SP+

15、 EES能能量量水水平平反應(yīng)過(guò)程反應(yīng)過(guò)程 G E1 E2 酶（E）與底物（S）結(jié)合生成不穩(wěn)定的中間物（ES），再分解成產(chǎn)物（P）并釋放出酶，使反應(yīng)沿一個(gè)低活化能的途徑進(jìn)行，降低反應(yīng)所需活化能，所以能加快反應(yīng)速度。 S + E ES P + ES + E ES P + E底物底物 酶酶 中間產(chǎn)物中間產(chǎn)物 產(chǎn)物產(chǎn)物 酶酶1、酶的活性中心和必需基團(tuán) 酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的區(qū)域叫 酶的活性中心（active center）或活性部位（active site），參與構(gòu)成酶的活性中心和維持酶的特定構(gòu)象所必需的基團(tuán)為酶分子的必需基團(tuán)。必需基團(tuán)必需基團(tuán):酶分子中有些基團(tuán)若經(jīng)化學(xué)修飾（

16、氧化、還原、?；?、烷化）使其改變，則酶的活性喪失，這些基團(tuán)稱為必需基團(tuán)。非必需基團(tuán)非必需基團(tuán)：有的酶溫和水解掉幾個(gè)AA殘基，仍能表現(xiàn)活性，這些基團(tuán)即非必需基團(tuán)。2、酶的活性的研究手段 活酶的專一性研究 酶分子的化學(xué)修飾：差示標(biāo)記法，親和標(biāo)記法 X-射線衍射法必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性活性部位部位維持酶的空間結(jié)構(gòu)維持酶的空間結(jié)構(gòu)結(jié)合結(jié)合基團(tuán)基團(tuán)催化催化基團(tuán)基團(tuán)專一性專一性催化性質(zhì)催化性質(zhì)AspHisSer活性中心重要基團(tuán)活性中心重要基團(tuán): His57 , Asp102 , Ser195酶作用的專一性與分子機(jī)理酶作用的專一性與分子機(jī)理酶作用的酶作用的專一性專一性結(jié)構(gòu)專一性結(jié)構(gòu)專一性立體異構(gòu)立體異構(gòu)專一性

17、專一性絕對(duì)專一性絕對(duì)專一性相對(duì)專一性相對(duì)專一性旋光異構(gòu)專一性旋光異構(gòu)專一性幾何異構(gòu)專一性幾何異構(gòu)專一性鍵專一性鍵專一性基團(tuán)專一性基團(tuán)專一性1 專一性分類專一性分類（芳香）（芳香） （賴、精）（賴、精）丙丙,甘甘,亮亮,異亮異亮,纈纈胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶“鎖鑰學(xué)說(shuō)” (lock and key thoery)： Fischer，(1890）：酶的活性中心結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)互相吻合，緊密結(jié)合成中間絡(luò)合物。誘導(dǎo)嵌合學(xué)說(shuō) (induced-fit hypothesis)： Koshland，(1958）：酶活性中

18、心的結(jié)構(gòu)有一定的柔性，當(dāng)?shù)孜铮せ顒┗蛞种苿┡c酶分子結(jié)合時(shí)，酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生了有利于與底物結(jié)合的變化，使反應(yīng)所需的催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)正確地排列和定向，轉(zhuǎn)入有效的作用位置，這樣才能使酶與底物完全吻合，結(jié)合成中間產(chǎn)物。1 1 底物與酶的鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)底物與酶的鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)2 2 底物分子的形變和扭曲底物分子的形變和扭曲3 3 酸堿催化酸堿催化4 4 共價(jià)催化共價(jià)催化5 5 金屬離子的作用金屬離子的作用6 6 活性部位的微環(huán)境的影響活性部位的微環(huán)境的影響酶分子為酶的催化提供各種功能基團(tuán)和形成特定的活性中心，酶與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物，使分子間的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃品肿觾?nèi)的催化反應(yīng)。 影響酶促反

19、應(yīng)速度的因素影響酶促反應(yīng)速度的因素 1 底物濃度底物濃度 2 酶濃度酶濃度 3 pH 4 溫度溫度 5 激活劑激活劑 6 抑制劑抑制劑 酶的活力與測(cè)定酶的活力與測(cè)定四、四、 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) (kinetics of enzyme-catalyzed reactions)是研究酶促反應(yīng) 速度及其影響因素的科學(xué)。酶促反應(yīng)速度的測(cè)定酶促反應(yīng)速度的測(cè)定 初速度初速度的概念的概念酶活力酶活力 檢測(cè)酶含量及存在，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來(lái)表示，而常用酶催化某一特定反應(yīng)的能力來(lái)表示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力，酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反

20、應(yīng)的速度來(lái)確定。1 酶促反應(yīng)初速度的概念酶促反應(yīng)初速度的概念斜率斜率=P/ t = V（初速度初速度）Pt用一定時(shí)間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物生成的量來(lái)表示酶促反應(yīng)速度。測(cè)定反應(yīng)的初速度?；盍挝唬╝ctive unit） 習(xí)慣單位（U）: 底物(或產(chǎn)物)變化量 / 單位時(shí)間 國(guó)際單位（IU）: 1moL變化量 / 分鐘 Katal（Kat）：1moL變化量 / 秒比活力=總活力單位總活力單位總蛋白總蛋白mg數(shù)數(shù)= U(或或IU) mg蛋白蛋白量度酶催化能力 大小轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每個(gè)酶分子量度酶純度比活力（specific activity）量度轉(zhuǎn)換效率 終點(diǎn)法: 酶反應(yīng)進(jìn)行

21、到一定時(shí)間后終止其反應(yīng)，再用化學(xué)或物理方法測(cè)定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化。 動(dòng)力學(xué)法:連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物底物或輔酶的變化量，直接測(cè)定出酶反應(yīng)的初速度。速度。1.稱取25mg蛋白酶配成25ml溶液，取2ml溶液測(cè)得含蛋白氮0.2mg，另取0.1ml溶液測(cè)酶活力，結(jié)果每小時(shí)可以水解酪蛋白產(chǎn)生1500ug酪氨酸，假定1個(gè)酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1ug酪氨酸的酶量。請(qǐng)計(jì)算：(1)酶溶液的蛋白濃度及比活力(2)每克酶制劑的總蛋白含量及總活力。解：(1)酶液蛋白濃度：0.26.25/2=0.625mg/ml, 0.1ml酶液中含1500/60=25u. 比活力：25u/0.10.625=400u/mg (

22、2)每克酶制劑中總蛋白：0.625克蛋白。那么總活力：400 u/mg0.625g=250000u2.甘油醛-3-磷酸脫氫酶，相對(duì)分子質(zhì)量4萬(wàn)，由4個(gè)相同亞基組成，每個(gè)亞基上有一個(gè)活性位點(diǎn)，在最適條件下，5g純酶制品每分鐘可以催化2.8mol甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油酸-3-磷酸。請(qǐng)計(jì)算酶的比活力和單個(gè)活性位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換數(shù)。解：依據(jù)活力單位的定義：每分鐘催化1mol的酶量為一個(gè)活力單位。上述純酶含2.8個(gè)活力單位。 依據(jù)比活力的定義：每毫克酶蛋白所含的活力單位數(shù)。該酶的比活力：2.8/510-3=560IU/mg 依據(jù)轉(zhuǎn)換數(shù)定義：每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)。 W=2.8/604=0.011

23、67 影響酶促反應(yīng)速度的因素影響酶促反應(yīng)速度的因素 MichaelisMenten曲線方程曲線方程米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的求解米氏常數(shù)的求解米氏常數(shù)的應(yīng)用米氏常數(shù)的應(yīng)用 在底物濃度很低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降。如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。此時(shí)，無(wú)論底物濃度增加多大，反應(yīng)速度也不再增加，說(shuō)明酶已被底物所飽和。所有的酶都有飽和現(xiàn)象，只是達(dá)到飽和時(shí)所需底物濃度各不相同而已。 為解釋酶被底物飽和現(xiàn)象，Michaelis和Menten做了大量的

24、定量研究，積累了足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 提出了酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程：米氏（米氏（MichaelisMenten）方程）方程 Vmax指該酶促反應(yīng)的最大速度，S為底物濃度，Km是米氏常數(shù)，VO是在某一底物濃度時(shí)相應(yīng)的反應(yīng)速度。從米氏方程可知：當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)， S Km ，此時(shí)VVmax ，反應(yīng)速度達(dá)最大速度，底物濃度再增高也不影響反應(yīng)速度。米氏方程的解釋米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的意義物理意義：Km值等于酶反應(yīng)速度為最大速度一半的底物濃度。Km-酶與底物親和力的關(guān)系值：Km愈大，酶與底物的親和力愈?。籏m值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度。

25、Km 值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)，酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件(如溫度、pH、有無(wú)抑制劑等)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時(shí)，Km 值也不同。各種酶的 Km 值范圍很廣，大致在 10-1-10-6 M 之間。KmKm在實(shí)際應(yīng)用中的重要意義在實(shí)際應(yīng)用中的重要意義（1）.鑒定酶：通過(guò)測(cè)定可以鑒別不同來(lái)源或相同來(lái)源但在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶。（2）.判斷酶的最佳底物：如果一種酶可作用于多個(gè)底物,就有幾個(gè)Km值，其中Km最小對(duì)應(yīng)的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水

26、解(Km=350mmol/L),兩者相比，蔗糖為該酶的天然底物。（3）.計(jì)算一定速度下的底物濃度：如某一反應(yīng)要求的反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的99%，則S=99KmKmKm求解法求解法 用1/V0 對(duì) 1/S 的作圖得一直線，其斜率是Km/Vmax,，在縱軸上的截距為 1/Vmax ,橫軸上的截距為 -1/Km。此作圖除用來(lái)求 Km 和 Vmax 值外，在研究酶的抑制作用方面還有重要價(jià)值。雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)作圖法2. 2. 酶濃度的影響酶濃度的影響在一定溫度和pH下，酶促反應(yīng)在底物濃度大大超過(guò)酶濃度時(shí)，速度與酶的濃度呈正比。酶濃度對(duì)速度的影響機(jī)理：酶濃度增加，ES也增加，

27、而V0=k3ES，故反應(yīng)速度增加。3. pH3. pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 大多數(shù)酶的活性受 pH 影響顯著，在某一 pH 下表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，酶活力顯著下降。酶表現(xiàn)最大活力的pH稱為酶的最適pH(optimumpH pHm)。典型的酶速度-pH曲線是較窄的鐘罩型曲線，但有的酶的速度-pH曲線并非一定呈鐘罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度-pH曲線。 動(dòng)物體內(nèi)多數(shù)酶的最適pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最適pH約1.8，肝精氨酸酶最適pH約為9.8(見(jiàn)下表)。 一些酶的最適pH 4. 4. 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 酶促反應(yīng)與其

28、它化學(xué)反應(yīng)一樣，隨溫度的增加，反應(yīng)速度加快。化學(xué)反應(yīng)中溫度每增加10反應(yīng)速度增加的倍數(shù)稱為溫度系數(shù)Q10。一般的化學(xué)反應(yīng)的Q10為2-3，而酶促反應(yīng)的Q10為1-2。 在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度稱為該酶促反應(yīng)的最適溫度（optimum temperature Tm）.一般動(dòng)物組織中的酶其最適溫度為35-40，植物與微生物中的酶其最適溫度為30-60，少數(shù)酶可達(dá)60以上，如細(xì)菌淀粉水解酶的最適溫度90以上。5. 5. 激活劑對(duì)酶反應(yīng)速度的影響激活劑對(duì)酶反應(yīng)速度的影響 能使酶活性提高的物質(zhì)，都稱為激活劑(activator)，其中大部分是離子或簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。如Mg+是多種激酶和

29、合成酶的激活劑，動(dòng)物唾液中的-淀粉酶則受Cl-的激活。 通常，酶對(duì)激活劑有一定的選擇性，且有一定的濃度要求，一種酶的激活劑對(duì)另一種酶來(lái)說(shuō)可能是抑制劑，當(dāng)激活劑的濃度超過(guò)一定的范圍時(shí)，它就成為抑制劑。 激活劑激活劑類類 別別 金屬離子：金屬離子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 陰離子：陰離子： Cl-、Br- 有機(jī)分子有機(jī)分子 還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金屬螯合劑：金屬螯合劑：EDTA6. 6. 抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的

30、抑制劑(inhibitor)。使酶變性失活(稱為酶的鈍化)的因素如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，不屬于抑制劑。通常抑制作用分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。 類型類型：可逆抑制劑可逆抑制劑 不可逆抑制劑不可逆抑制劑 應(yīng)用應(yīng)用：研制殺蟲(chóng)劑、藥物研制殺蟲(chóng)劑、藥物 研究酶的作用機(jī)理，確定代謝途徑研究酶的作用機(jī)理，確定代謝途徑 競(jìng)爭(zhēng)性抑制可逆抑制 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 非專一性不可逆抑制不可逆抑制 專一性不可逆抑制6.1 不可逆性抑制作用(irreversible inhibition) 不可逆性抑制作用的抑制劑，通常以共價(jià)鍵方式與酶的必需基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合而使酶喪失活性。常見(jiàn)的不可逆抑制劑如下圖所示。按其作用

31、特點(diǎn)，又分專一性及非專一性兩種。 這類抑制劑選擇性很強(qiáng)，它只能專一性地與酶活性中心的某些基團(tuán)不可逆結(jié)合，引起酶的活性喪失。 實(shí)例：有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX 抑制劑作用于酶分子中的一類或幾類基團(tuán)，這些基團(tuán)中包含了必需基團(tuán)，因而引起酶失活。類型：類型：6.2 可逆性抑制(reversible inhibition) 抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，在用透析等物理方法除去抑制劑后，酶的活性能恢復(fù)，即抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的。這類抑制劑大致可分為以下三類：競(jìng)爭(zhēng)性抑制 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitive inhibition)抑制劑I和

32、底物S對(duì)游離酶E的結(jié)合有競(jìng)爭(zhēng)作用，互相排斥，已結(jié)合底物的ES復(fù)合體，不能再結(jié)合I。同樣已結(jié)合抑制劑的EI復(fù)合體，不能再結(jié)合S。實(shí)例：磺胺藥物的藥用機(jī)理實(shí)例：磺胺藥物的藥用機(jī)理非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(non-competitive inhibition) 抑制劑I和底物S與酶E的結(jié)合完全互不相關(guān)，既不排斥，也不促進(jìn)結(jié)合，抑制劑I可以和酶E結(jié)合生成EI，也可以和ES復(fù)合物結(jié)合生成ESI。底物S和酶E結(jié)合成ES后，仍可與I結(jié)合生成ESI，但一旦形成ESI復(fù)合物，再不能釋放形成產(chǎn)物P。 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用+IEI+SESIESP+ EE+S+I實(shí)例：重金屬離子（實(shí)例：重金屬離子（Cu2+、Hg2+

33、、Ag+、Pb2+） 金屬絡(luò)合劑（金屬絡(luò)合劑（EDTA、F-、CN-、N3-）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線非競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線ViVmaxS( 1+ ) IKiKm+( )S反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑必須在酶結(jié)合了底物之后才能與酶與底物的中間產(chǎn)物結(jié)合，該抑制劑與單獨(dú)的酶不結(jié)合。 競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用底物與酶專一性結(jié)合底物與酶專一性結(jié)合 多酶體系多酶體系(multienzyme system)別構(gòu)酶別構(gòu)酶(allosteric enzyme)共價(jià)調(diào)節(jié)酶共價(jià)調(diào)節(jié)酶(covalent regulatory enzyme)酶原酶原(enzymogen或或proenzyme)的

34、激活的激活同工酶同工酶(isoenzyme)抗體酶抗體酶(abzyme)多功能酶多功能酶( multifunctional enzyme)或串聯(lián)酶或串聯(lián)酶(tandem enzyme)模擬酶、固定化酶等模擬酶、固定化酶等 細(xì)胞中的許多酶常常是在一個(gè)連續(xù)的反應(yīng)鏈中起作用，即前一個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物是后一個(gè)反應(yīng)的底物，在完整細(xì)胞內(nèi)的某一代謝過(guò)程中，由幾個(gè)酶形成的反應(yīng)體系，稱為多酶體系（multienzyme system）。 如果體系中幾種酶彼此有機(jī)地組合在一起。精巧地鑲嵌成一定的結(jié)構(gòu)，即形成多酶復(fù)合體。這種結(jié)構(gòu)即能提高反應(yīng)途徑的效率，又能增強(qiáng)調(diào)控的準(zhǔn)確性。分散多酶體系與中分散多酶體系與中間物示意圖間物示

35、意圖多酶復(fù)合體示意圖多酶復(fù)合體示意圖概念：酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價(jià)結(jié)合后導(dǎo)致酶分子發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而改變酶的活性狀態(tài)，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)(allosteric regulation)，具有這種調(diào)節(jié)作用的酶稱別構(gòu)酶(allosteric enzyme)。別構(gòu)酶促反應(yīng)底物濃度和反應(yīng)速度的關(guān)系不符合米氏方程，呈S型曲線。 凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為效應(yīng)物(effector)，通常為小分子代謝物或輔因子。如因別構(gòu)導(dǎo)致酶活性增加的物質(zhì)稱為正效應(yīng)物(positive effector)或別構(gòu)激活劑，反之稱負(fù)效應(yīng)物(negative effector)或別構(gòu)抑制劑。 別構(gòu)調(diào)節(jié)普遍存在

36、于生物界，許多代謝途徑的關(guān)鍵酶利用別構(gòu)調(diào)節(jié)來(lái)控制代謝途徑之間的平衡，研究別構(gòu)調(diào)控有重要的生物學(xué)意義。實(shí)例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 （anspartate transcarbamoylase，ATCase）別構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)機(jī)理：序變模型和齊變模型效應(yīng)劑效應(yīng)劑別別構(gòu)構(gòu)中中心心活性活性中心中心A （產(chǎn)物或中間產(chǎn)物）（產(chǎn)物或中間產(chǎn)物）EDCB關(guān)鍵酶關(guān)鍵酶 A-非調(diào)節(jié)酶非調(diào)節(jié)酶B-正協(xié)同別構(gòu)酶正協(xié)同別構(gòu)酶 的的S形曲線形曲線 1-非調(diào)節(jié)酶非調(diào)節(jié)酶2-正協(xié)同別構(gòu)酶正協(xié)同別構(gòu)酶3-負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶ATCase變構(gòu)效應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征變構(gòu)效應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征ATP（正效應(yīng)劑）（正效應(yīng)劑）CTP（負(fù)效應(yīng)劑）（負(fù)效應(yīng)劑

37、）低催化活性構(gòu)象低催化活性構(gòu)象T(tense) - 態(tài)態(tài)CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性構(gòu)象高催化活性構(gòu)象R(relax) -態(tài)態(tài)R RR RR RVmax1/2VmaxKmSS SS SSSSSSSSSS亞基全部亞基全部處于處于R型型亞基全部亞基全部處于處于T型型依次序變化依次序變化S SSSS SSS SST狀態(tài)（對(duì)稱亞基）狀態(tài)（對(duì)稱亞基）R狀態(tài)（對(duì)稱亞基）狀態(tài)（對(duì)稱亞基）SSSS對(duì)稱亞基對(duì)稱亞基對(duì)稱亞基對(duì)稱亞基齊步變化齊步變化 某些酶可以通過(guò)其它酶對(duì)其多肽鏈上某些基團(tuán)進(jìn)行可逆的共價(jià)修飾，使其處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶活性。這類酶稱為共價(jià)修飾酶。目前發(fā)

38、現(xiàn)有數(shù)百種酶被翻譯后都要進(jìn)行共價(jià)修飾，其中一部分處于分支代謝途徑，成為對(duì)代謝流量起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶或限速酶。 由于這種調(diào)節(jié)的生理意義廣泛，反應(yīng)靈敏，節(jié)約能量，機(jī)制多樣，在體內(nèi)顯得十分靈活，加之它們常受激素甚至神經(jīng)的指令，導(dǎo)致級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，所以日益引人注目。 AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g關(guān)鍵酶（限速酶）關(guān)鍵酶（限速酶）P2蛋白激酶蛋白激酶ATPADP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Pn蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶nPiH2O反應(yīng)類型反應(yīng)類型 共價(jià)修飾共價(jià)修飾 被修飾的氨基酸殘基被修飾的氨基酸殘基共共價(jià)價(jià)修修飾飾反反應(yīng)應(yīng)的的例例子子磷酸化磷酸化腺苷酰化腺苷?；蜍挣；蜍挣；疶yr,Ser,Thr.

39、HisTyrTyr甲基化甲基化GluS-腺苷腺苷-MetS-腺苷腺苷-同型同型 Cys意義：由于酶的共價(jià)修飾反應(yīng)是酶促反應(yīng)，只要有少量信號(hào)分子（如激素）存在，即可通過(guò)加速這種酶促反應(yīng)，而使大量的另一種酶發(fā)生化學(xué)修飾，從而獲得放大效應(yīng)。這種調(diào)節(jié)方式快速、效率極高。腎上腺素或腎上腺素或胰高血糖素胰高血糖素1、腺苷酸環(huán)化酶、腺苷酸環(huán)化酶（無(wú)活性）（無(wú)活性）腺苷酸環(huán)化酶（活性）腺苷酸環(huán)化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶、蛋白激酶（無(wú)活性）（無(wú)活性）蛋白激酶（活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶、磷酸化酶激酶（無(wú)活性）（無(wú)活性）磷酸化酶激酶（活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶、

40、磷酸化酶 b（無(wú)活性）（無(wú)活性）磷酸化酶磷酸化酶 a（活性）（活性）6、糖原、糖原6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖葡萄糖葡萄糖血液血液ATP ADPATP ADP腎上腺素或腎上腺素或胰高血糖素胰高血糖素132 102 104 106 108葡萄糖葡萄糖456（極微量）（極微量）（大量）（大量） 有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成時(shí)，或初分泌時(shí)，沒(méi)有催化活性，這種無(wú)活性狀態(tài)的酶的前體稱為酶原(zymogen)。酶原向活性的酶轉(zhuǎn)化的過(guò)程稱為酶原的激活。酶原激活實(shí)際上是酶的活性中心形成或暴露的過(guò)程。 酶原激活及意義酶原激活及意義 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、彈性蛋白酶在它們初分泌時(shí)都是以

41、無(wú)活性的酶原形式存在，在一定條件下才轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酶。 例如，胰蛋白酶原進(jìn)入小腸后，受腸激酶或胰蛋白酶本身的激活，第6位賴氨酸與第7位異亮氨酸殘基之間的肽鍵被切斷，水解掉一個(gè)六肽，酶分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，產(chǎn)生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原變成了有活性的胰蛋白酶。 在于避免細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并可使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝的正常進(jìn)行.胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶六肽六肽腸腸激激酶酶活性中心活性中心 概念：概念：存在于同一種屬或不同種屬，同一個(gè)體的不同組織或同一組織、同一細(xì)胞，具有不同分子形式但卻能催化相同的化學(xué)反應(yīng)的一組酶，稱之為同工酶（isoenzym

42、e）。乳酸脫氫酶是研究的最多的同工酶。 生物學(xué)功能生物學(xué)功能 遺傳的標(biāo)志 和個(gè)體發(fā)育及組織分化密切相關(guān) 適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不 同需要 同工酶同工酶(isoenzyme)多肽多肽亞基亞基mRNA四聚體四聚體結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因a b乳酸脫氫酶同乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜工酶電泳圖譜+H4MH3M2H2M3HM4點(diǎn)樣線點(diǎn)樣線LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)心肌心肌 腎腎 肝肝 骨骼肌骨骼肌 血清血清-+原點(diǎn)原點(diǎn) (1) 遺傳學(xué)和分類學(xué)：提供了一種精良的判別遺傳標(biāo)志的工具。(2) 發(fā)育學(xué)：有效地標(biāo)志細(xì)胞類型及細(xì)胞在不同條件下的分化情況

43、，以及個(gè)體發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系。(3) 生物化學(xué)和生理學(xué)：根據(jù)不同器官組織中同工酶的動(dòng)力學(xué)、底物專一性、輔助因子專一性、酶的變構(gòu)性等性質(zhì)的差異，從而解釋它們代謝功能的差別。（4）醫(yī)學(xué)和臨床診斷：體內(nèi)同工酶的變化，可看作機(jī)體組織損傷，或遺傳缺陷，或腫瘤分化的的分子標(biāo)志。 抗體酶（abzyme）又稱催化抗體（catalytic antibody）,是指通過(guò)一系列化學(xué)與生物技術(shù)方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應(yīng)免疫學(xué)性質(zhì)，還類似于酶，能催化某種活化反應(yīng)。 抗體與酶相似，都是蛋白質(zhì)分子，酶與底物的結(jié)合及抗體與抗原的結(jié)合都是高度專一性的，但這兩種結(jié)合的基本區(qū)別在于酶與高能的過(guò)度態(tài)分子向結(jié)合，

44、而抗體則與抗原（基態(tài)分子）相結(jié)合。利用抗體能與抗原特異結(jié)合的原理可用過(guò)度態(tài)類似物作為半抗原來(lái)誘發(fā)抗體，這樣產(chǎn)生的抗體便能特異地識(shí)別反應(yīng)過(guò)程中真正的過(guò)渡分子，從而降低反應(yīng)的活化能,達(dá)到催化反應(yīng)的目的，這種具有催化功能的抗體就被稱為催化抗體或抗體酶。 O C A. 酯酶的底酯酶的底物物酯酯B.酯的羰基碳酯的羰基碳原子受到親核原子受到親核攻擊形成四面攻擊形成四面體過(guò)渡態(tài)體過(guò)渡態(tài)C.設(shè)計(jì)的磷酸設(shè)計(jì)的磷酸酯類似物酯類似物,作作為抗原去免疫為抗原去免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物磷酸酯類似物磷酸酯類似物(半抗原半抗原)對(duì)酯水解反應(yīng)有催化對(duì)酯水解反應(yīng)有催化作用的單克隆抗體作用的單克隆抗體免疫免疫免疫反應(yīng)免疫反應(yīng) 對(duì)已產(chǎn)

45、生的單抗，分析氨基酸的組成或相應(yīng)基因的堿基序列，對(duì)抗體結(jié)合的部位的基因進(jìn)行定位突變，在抗體結(jié)合部位換上有催化活性的氨基酸，基因工程的技術(shù)使得建立抗體基因的組合文庫(kù)，并根據(jù)需要構(gòu)建適當(dāng)程序的基因片段成為可能。 在抗體酶研究中，一個(gè)不可少的步驟是在細(xì)胞融合后篩選到能分泌催化抗體的細(xì)胞克隆。一般的方法是先篩選其抗體能結(jié)合特異抗原的細(xì)胞克隆，再?gòu)募兓目贵w中篩選出有催化能力的單抗。主要篩選方法有生物學(xué)篩選法和純化學(xué)篩選法。 催化抗體的出現(xiàn)不僅為人們開(kāi)創(chuàng)了一條人工設(shè)計(jì)酶的新方法，也使人們對(duì)催化過(guò)程中催化劑的作用機(jī)理和催化劑和底物的相互識(shí)別有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有催化作用的自身抗體在生物體內(nèi)的存在，其不僅和疾病相關(guān)，可能還參與了生物體內(nèi)的某些或基本的生物學(xué)反應(yīng)。有可能成為抗體酶研究的新熱點(diǎn)。 充分利用抗體的種類繁多以及抗體酶的可誘導(dǎo)、可改造的特點(diǎn)，可望制備出具有治療和輔助治療某些疾病或催化某類具有特殊意義反應(yīng)的