大鼠腦液壓沖擊傷后細胞色素C表達的實驗研究

1、大鼠腦液壓沖擊傷后細胞色素C表達的實驗研究摘要目的為法醫(yī)學上閉合性顱腦損傷的早期診斷和損傷時間推斷提供依據(jù)。方法建立大鼠腦液壓沖擊模型。用免疫組化與圖像分析技術分別檢測傷后不同時間大鼠腦皮質、海馬等部位細胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)的表達。結果對照組大鼠腦內Cyt C有微量表達,傷后15分鐘表達代寫論文網開始增強,傷后3小時達高峰,1天后開始減弱,7天后基本恢復正常。結論Cyt C表達的規(guī)律性可望為閉合性顱腦損傷的早期診斷及損傷時間推斷提供依據(jù)。關鍵詞閉合性顱腦損傷;Cyt C;免疫組織化學顱腦損傷在法醫(yī)病理學鑒定中十分常見。已有研究表明,腦損傷后腦血管,特別是腦內小動脈及

2、小靜脈發(fā)生痙攣收縮,腦血流量減少,引起腦部缺血缺氧。細胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)是呼吸鏈中的必要成分之一,在線粒體復合物、之間傳遞電子。近來有研究發(fā)現(xiàn)腦缺氧后神經元線粒體功能損傷并釋放CytC是神經元損害的中心環(huán)節(jié)。目前關于Cyt C在閉合性顱腦損傷的診斷與損傷時間推斷方面的研究報道較少。本研究對大鼠腦部進行液壓沖擊造成閉合性顱腦損傷,觀察傷后大鼠腦內Cyt C的表達情況,以期為閉合性顱腦損傷的早期診斷及損傷時間推斷提供依據(jù)。材料與方法一、實驗動物分組 健康雄性Wistar大鼠50只,體重300350 g(由四川大學華西實驗動物中心提供)。隨機分為10組,分別對應于正常對

3、照組,手術對照組,損傷后15min、1h、3h、6h、12h、1d、4d、7d組,每組5只。二、動物模型的制備 實驗動物經10%水合氯醛按0.3g/kg體重腹腔麻醉,采用張永亮改進的Dixon液壓沖擊裝置制造損傷模型。分別于傷后15min、1h、3h、6h、12h、1d、4d、7d以4%多聚甲醛溶液進行主動脈灌注固定處死。在腦打擊處尾側3mm部位作冠狀切面,常規(guī)石蠟包埋、切片。正常對照組大鼠飼養(yǎng)1d后直接處死,手術對照組大鼠僅行顱骨鉆孔,不做液壓沖擊,術后2h處死。兩組動物取材及組織后處理同實驗組。三、主要試劑 兔抗鼠Cyt C多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。山羊抗兔SP試劑盒、DA

4、B顯色劑(北京中山生物技術有限公司)。四、染色 HE染色按常規(guī)操作進行,免疫組化染色按試劑說明書進行,以PBS代替一抗作陰性對照。五、圖像分析及統(tǒng)計學處理 在皮質及海馬區(qū)隨機選取5個視野,用Biomias圖像分析儀測量Cyt C免疫陽性物面積及陽性細胞染色強度。測定數(shù)值用s表示,用SPSS 10.0 for Windows進行統(tǒng)計分析。實驗結果一、HE染色觀察 正常對照組和手術對照組無明顯異常改變,實驗見大腦皮質及蛛網膜下腔出血,腦實質小灶性出血。分神經元固縮,核小而深染,以挫傷灶周邊分布居多;分神經元腫脹,彌散分布于腦實質內。傷后1h腦水明顯,傷后7d損傷周邊見膠質細胞增生。二、免疫組化染色

5、結果 正常對照組和手術對照組大鼠腦皮質和海馬神元均有Cyt C低水平表達,光鏡下,可見神經元胞漿有少許棕黃色免疫反應陽性物(見圖1、2)。傷15min,大鼠腦皮質和海馬神經元Cyt C表達開始增強傷后3h,大鼠腦皮質和海馬神經元Cyt C表達達高峰光鏡下,可見神經元胞漿內有大片棕黃色免疫反應陽物沉積(見圖3、4)。免疫反應高表達持續(xù)到傷后1d,后Cyt C表達逐漸降低,傷后7d,基本恢復至對照組平。三、圖像分析各組均進行了圖像分析,結果見表1,2。討論根據(jù)Ohms定律,腦血流量的調節(jié)主要依賴于灌流壓和血管阻力。在血壓為6.1513.85kPa范圍內,腦血流量主要通過腦小動脈和微動脈血管壁平滑肌

6、收縮和舒張改變血管徑而進行自動調節(jié)。于曉軍等制作大鼠閉合性腦損傷模型,用掃描電鏡對血管鑄型進行觀察,發(fā)現(xiàn)損傷組大鼠腦內小動脈痙攣收縮,管徑明顯小于正常組大鼠腦血管管徑。這可能是因為機械性外力刺激腦部后,腦血管受機械性牽拉,血管平滑肌發(fā)生牽張性收縮反射的結果。腦血管痙攣收縮是外傷后腦組織缺血缺氧的主要原因。腦組織以有氧代謝為主,幾乎沒有無氧代謝能力,對氧的需求量高。同時,腦組織中氧和ATP的儲備很少。因而對缺氧的耐受性差,是機體對缺氧最敏感的組織。缺氧后神經元線粒體ATP含量迅速下降,線粒體功能受損。線粒體功能障礙后,線粒體外膜通透性增高,Cyt C釋放入細胞質,線粒體內Cyt C減少,直接使細

7、胞呼吸鏈電子傳遞中斷,導致神經元壞死。釋放到胞質中的Cyt C還與Apaf-1,Caspase-9一起裝配組成凋亡復合體,引起神經元凋亡。壞死和凋亡正是腦損傷后神經元死亡的兩種方式,只是發(fā)生的時間不同。壞死在傷后不久發(fā)生,而凋亡在傷后數(shù)小時才開始發(fā)生。Ptrick G.Sulliven等用Western Blot法研究腦損傷后神經元Cyt C的釋放情況,發(fā)現(xiàn)傷后3h、6h、12h、24h神經元胞漿中Cyt C持續(xù)增強,72h后又有所下降,而線粒體中Cyt C的含量則隨時間變化而不斷下降。陳施艷等制作大鼠缺血模型,發(fā)現(xiàn)大鼠在常溫下缺血3h后,海馬CA1區(qū)神經元有大量Cyt C陽性表達,24h后表達明顯減少,72h后完全消失。本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腦液壓沖擊傷后15min在鼠腦皮質、海馬等部位C