燈盞花提取成分對體外高壓培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡基因表達的影響

1、燈盞花提取成分對體外高壓培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡基因表達的影響    摘要   目的   觀察燈盞花提取物（DSX）對體外高壓培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡及凋亡基因表達的影響。 方法   （1）在RGCs中加入DSX，加壓培養(yǎng)后收集細胞，用流式細胞儀測定凋亡細胞百分率。（2）在RGCs中加入DSX，加壓培養(yǎng)后收集細胞，用基因芯片尋找凋亡基因的表達。結(jié)果   （1）在RGCs高壓培養(yǎng)時，DSX組的凋亡百分率低于模型組和對照組。（2）在高壓培養(yǎng)的條件下，與神經(jīng)元細胞凋亡相關的基因S1

2、00B表達恢復正常，NGFR表達下調(diào)。 結(jié)論   DSX是具有RGCs保護作用的有效單體，能使高壓培養(yǎng)RGCs的S100B的表達恢復正常，NGFR的表達下調(diào)。     關鍵詞   視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；細胞培養(yǎng)；壓力；細胞凋亡    Apoptotic genetic expression of  RGCs by bolting constituent from Herba Erigerontis cultured in vitro by high pressure  

3、      Abstract   Objective   To observe the apoptosis and look for apoptotic gene of RGCs cultured in vitro by high pressure by adding the constituent come from Herba Erigerontis（DSX）.  Methods   We build rat retinal cells and RGCs cultured

4、 in virto by high pressure.Put 80 mmHg pressure to RGCs in close tightly culturebottle for four hours， then collect RGCs and check the sum of apoptosis cells by flow cytometry(FCM).Put the pressure 80 mmHg to RGCs in close tightly culturebottle for four hours，then collect RGCs and look for the apopt

5、otic gene by gene chip. Results   The apoptosis of model group and control group higher than DSX group cultured  in the pressure of 80 mmHg.Two apoptotic gene (S100B，NGFR) express upregulation. Conclusion   DSX was the most effective constituent in protecting RGCs in vitro.T

6、he expressing upregulation of  S100B and NGFR is the direct reasons of the apoptosis of RGCs by pressure.    Key words   retinal cells;retinal ganglion cells; cell culture;pressure;apoptosis     青光眼系具有病理性高眼壓或正常眼壓合并視乳頭、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層損害及青光眼性視野改變的一種致盲性的眼病，目前臨床療效不理

7、想，尤其是控制眼壓后，患者視功能仍然繼續(xù)下降，所以尋找對視神經(jīng)具有保護作用的藥物成為新的要求。DSX是從中藥燈盞花中提取的有效成分。目前已證明以DSX為主要組分制備的優(yōu)視膠囊具有活血化瘀、通竅明目的作用，能保護高眼壓狀態(tài)下的RGCs免受或少受損傷并挽救凋亡細胞1，2，在此基礎上，我們希望能明確其作用機制，為進一步研究的劑型做準備。    1   材料與方法    1.1   實驗動物   SD乳鼠（13日齡），由成都中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。  

8、0; 1.2   主要試劑   層粘連蛋白（ROCHE公司）、多聚鳥氨酸、硼酸、硼砂（沈陽化學試劑廠）、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）、羊抗鼠IgG（華美生物工程公司）、小鼠抗大鼠單克隆抗體和PI（SIGMA公司）、DEPC（Sigma公司）、trizol（Invitrogen公司）、EDTANa2（國藥集團化學試劑有限公司）NucleoSpin RNA cleanup試劑盒（MACHEREYNAGEL，Germany）等。DSX由中藥燈盞花提取。    1.3   主要儀器 

9、60; HBO50型倒置相差顯微鏡（德國ZEISS公司）、超凈工作臺（蘇州醫(yī)療器械廠）、MCO-150A型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司）、大鼠Oligo芯片、LuxScan 10KA雙通道激光掃描儀（CapitalBio公司）等。    1.4   培養(yǎng)器皿的制備   25 cm2培養(yǎng)瓶和直徑35 mm培養(yǎng)皿（內(nèi)置蓋玻片），以0.1 mg/ml多聚鳥氨酸（polyLornithine，硼酸緩沖液稀釋）室溫包被2 h后，再以4 g/ml層粘連蛋白(laminin， PBS液稀釋)包被，37 過夜備用。以羊抗鼠IgG（1100，

10、PBS液稀釋）室溫包被培養(yǎng)皿24 h，繼以小鼠抗大鼠Thy-1.1單克隆抗體（1150，PBS液稀釋）室溫包被24 h。    1.5   RGCs的培養(yǎng)   出生13天SD乳鼠20只斷頭處死，無菌條件下取眼球，體視顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜，0.125%胰蛋白酶消化20 min，用220目網(wǎng)眼無菌鋼網(wǎng)濾過，小牛血清終止消化，1000 r/min離心5 min，去上清，加20%DMEM培養(yǎng)液，用吸管反復吹打，使細胞分散均勻，制成細胞懸液后加入經(jīng)羊抗鼠IgG和小鼠抗大鼠Thy-1.1單克隆抗體包被的培養(yǎng)皿，37 條件下孵育30 m

11、in，使視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞與Thy-1.1單克隆抗體充分結(jié)合，去上清，用無血清培養(yǎng)液反復漂洗，清除培養(yǎng)皿表面未黏附的細胞，用0.125%胰蛋白酶消化10 min，小牛血清終止消化，1000 r/min離心5 min，去上清，加20%DMEM培養(yǎng)液，用吸管反復吹打，使細胞分散均勻，制成細胞懸液。計數(shù)后按每瓶5×105個細胞加入經(jīng)多聚鳥氨酸和粘連蛋白包被的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿。    1.6   視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞體外培養(yǎng)   按以上方法制備的純化RGCs，培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)皿內(nèi)置的蓋玻片，固定，用Pischinger法進

12、行鑒定。    按以上方法制備的純化RGCs 18瓶，培養(yǎng)24 h后隨機分為3組，實驗組加入DSX（終濃度0.1 mg/ml），模型組和空白對照組不加藥物，實驗組和模型組用帶T型三通管的橡皮塞將培養(yǎng)瓶密閉，用打氣球從T型三通管注入除菌空氣，從與培養(yǎng)瓶相通的壓力表中讀取壓力值，達到預定的80 mmHg，加壓時間4 h，空白對照組不加壓，37 ，5%CO2孵箱培養(yǎng)，并在規(guī)定時間取出，利用流式細胞儀進行凋亡細胞的檢測。    按以上方法制備的純化RGCs 30瓶，培養(yǎng)24 h后隨機分為3組，每組10瓶，實驗組加入DSX（終濃度0.1 mg/

13、ml），模型組和空白對照組不加藥物，實驗組和模型組用帶T型三通管的橡皮塞將培養(yǎng)瓶密閉，用打氣球從T型三通管注入除菌空氣，從與培養(yǎng)瓶相通的壓力表中讀取壓力值，達到預定的80  mmHg，加壓時間4 h，空白對照組不加壓，37 ，5%CO2孵箱培養(yǎng)，并在規(guī)定時間取出，利用基因芯片進行凋亡基因的檢測。    1.7   統(tǒng)計學方法   采用SPSS 14.0版統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較用q檢驗，差異基因的表達用t檢驗。    2   結(jié)果    2.1   視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的鑒定結(jié)果   Nissel小體染色檢查：免疫組化染色結(jié)果顯示細胞胞漿內(nèi)有藍色顆粒，證實細胞類型為神經(jīng)元細胞。因此，依據(jù)細胞的組織來源、細胞的形態(tài)以及免疫組化染色結(jié)果可判斷此種細